Inhibición de la tristetrapolina para proteger el corazón de lesiones cardíacas.

Un método para la detección de un compuesto por su capacidad para aumentar la producción del factor de necrosis tisular a (TNFa) inhibiendo y/o revirtiendo la unión de la tristetraprolina (TTP) al ARNm de TNFa,

que comprende:

a) poner en contacto el compuesto con una muestra sin células que contenga ARNm de TNF5 a o con una muestra sin células que contenga una construcción de expresión capaz de expresar parte de la región 3' no traducida del ARNm de TNFa que abarca los fragmentos conocidos de elementos ricos en AU (ARE) que se sabe desestabilizan el ARNm de TNF-a fusionado a un gen indicador en presencia de TTP en condiciones que permitan la expresión de la proteína indicadora, y

b) determinar el nivel de expresión de TNFa o de la proteína indicadora y comparar dicho nivel con el nivel de expresión obtenido en ausencia del compuesto y

c) seleccionar compuestos que potencien la expresión de la proteína indicadora en comparación con el nivel de expresión obtenido en ausencia del compuesto.

Inhibición de la tristetraprolina para proteger el corazón de lesiones cardíacas Campo de la invención La presente invención se refiere a compuestos adecuados para el tratamiento de afecciones que pueden mejorar, al menos en parte, aumentando la producción del factor de necrosis tumoral α (TNFα) . La invención además se refiere a ensayos para la identificación de un individuo en mayor riesgo o que sufre tales afecciones y a los métodos de detección de compuestos por su capacidad para estimular la biosíntesis de TNFα.

Antecedentes de la invención El TNFα es una potente citoquina secretada por muchos tipos de células. El TNFα también se encuentra sobre las células en una forma de mayor peso molecular unida a la membrana celular y parece que esta forma también media en diversos efectos biológicos. Se piensa que el TNFα tiene una escasa función en el desarrollo y la fisiología normales; sin embargo, ejerce efectos nocivos y destructivos sobre muchos tejidos en muchos estados patológicos (Tracey y col., Ann. Rev. Med. 1994; 45:491) . Entre los estados patológicos en los que se ha demostrado que el TNFα ejerce un papel importante se incluyen el síndrome de choque septicémico, la caquexia cancerosa, la artritis reumatoide, etc.

Por el contrario, los estudios experimentales de varios laboratorios han demostrado que en el corazón de mamíferos adultos se sintetiza ARNm de TNFα después de determinadas formas de estrés (Bader y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994; 91:11831; Giroir y col., J. Clin. Invest. 1992; 90:693; Giroir y col., Am. J. Physiol. 1994; 267:H118) .

La observación repetida de que el TNFα se expresa prácticamente en todas las formas de lesión cardiaca tanto en mamíferos grandes como pequeños, incluyendo, aunque sin limitaciones, infarto de miocardio (Mauri y col., J. Intern. Med. 1989; 225:333; Basaran y col., Angiology. 1993; 44:332) , angina inestable (Matsumori y col., Br. Heart

J. 1994; 72:566) , sobrecarga hemodinámica (Kapadia y col., J. Clin. Invest. 1995; 96:1042) , lesión miocárdica por reperfusión (Lefer y col., Science. 1990; 249:61; Herskowitz y col., Am. J. Pathol. 1995;146:419) , cardiomiopatía hipertrófica (Matsumori y col., Br. Heart. J. 1994;72:561) e insuficiencia cardiaca congestiva en fase terminal (Levine y col., N. Engl. J. Med. 1990; 223:236; Torre-Amione y col., Circulation. 1996; 93:704) sugiere que el TNFα puede actuar en el corazón como un "gen innato de respuesta al estrés" filogenéticamente conservado.

A este respecto, la observación de que el TNFα confiere resistencia al estrés hipóxico en el tejido cardiaco adulto sugiere que la producción de TNFα por parte del tejido cardiaco lesionado y/o estresado puede constituir un mecanismo autocrino/paracrino/yuxtacrino local para proteger a las células vecinas dentro del corazón (Nakano y col., Circulation. 1998; 97:1392) .

Se sabe que periodos breves de oclusión de la arteria coronaria seguidos de reperfusión protegen al corazón de posteriores periodos de afecciones isquémicas que de otro modo serían mortales. Sin embargo, este primer periodo protector concluye en varias horas. Veinticuatro horas después de la isquemia inicial, se produce un "segundo periodo de protección" (SPP) que puede durar varios días, dependiendo de la especie utilizada y de las condiciones experimentales. Además de los periodos de oclusión/reperfusión, se sabe también que varias sustancias como la adenosina y el lipopolisacárido (LPS) inducen un SPP.

Entre otros, la expresión de iNOS (óxido nítrico sintetasa inducible) se considera un mediador importante del SPP. La iNOS en sí es inducida por el TNFα, que se expresa, por ejemplo, después de la inducción de un SPP por el LPS. La expresión del TNFα parece ser necesaria para el desarrollo del SPP. Por tanto, un nivel elevado de TNFα puede tener un uso terapéutico en afecciones que pueden mejorar, al menos en parte, por el aumento de la producción de TNFα, incluido, aunque sin limitaciones, enfermedades cardiacas y/o lesiones cardiacas o para la prevención del daño por reperfusión.

La presente invención se refiere a una nueva estrategia para el tratamiento de afecciones que pueden mejorar, al menos en parte, aumentando la producción de TNFα. Esta estrategia supone el uso de un ADNc o un ARNc complementario al ARNm de TTP o un anticuerpo anti-TTP que se una específicamente a TTP o fragmentos de dichos anticuerpos.

La TTP (Lai y col., J. Biol. Chem. 1990; 265:16556) , también conocida como Nup475 (DuBois y col., J. Biol. Chem. 1990; 265:19185) y TIS11 (Varnum y col., Oncogene 1989; 4:119; Varnum y col., Mol. Cell. Biol. 1991; 11:1754) , es una fosfoproteína de 33 kDa ampliamente distribuida codificada por el gen de respuesta inmediata-temprana Zfp-36 (Taylor y col., Nucl. Acids Res. 1991; 19:3454) . Este gen se ha mapeado en el cromosoma 7 del ratón, y el gen humano equivalente (ZFP36) se ha mapeado en el cromosoma 19q13.1 (Taylor y col., Nucl. Acids Res. 1991; 19:3454) . TTP es el prototipo de un grupo de proteínas que contienen dos o más posibles dedos de cinc altamente conservados de la clase CCCH (Varnum y col., Mol. Cell. Biol. 1991; 11:1754; Taylor y col., Nucleic Acids Res. 1991; 19:3454; Gomperts y col., Oncogene. 1990; 5:1081; Ma y col., Oncogene. 1994; 9:3329) . Asimismo, se ha demostrado que la proteína une Zn2+ y se ha localizado en el núcleo celular en fibroblastos de ratón (DuBois y col., J. Biol. Chem. 1990; 265:19185) , lo que sugiere que puede tratarse de un factor de transcripción. La estimulación con suero u otro mitógeno de fibroblastos quiescentes causa la rápida fosforilación de la serina y la traslocación del núcleo al citosol de la TTP (Taylor y col., J. Biol. Chem. 1995; 270:13341) , siendo probable que ambos sucesos modulen su función en las células.

Recientemente se ha demostrado que TTP interviene en la regulación del TNFα en macrófagos (Carballo y col., Science 1998; 281:2001) . Los lipopolisacáridos y el TNFα inducen la expresión de TTP. La TTP se une a un elemento rico en AU (ARE) en el extremo 3 prima de la molécula de ARNm de TNFα, desestabilizando así dicho ARNm.

En el documento WO 97/42820 se han utilizado las propiedades de TTP para el tratamiento de enfermedades asociadas con el exceso de TNFα, como el síndrome del choque septicémico, caquexia cancerosa, artritis reumatoide, etc. Se describen los métodos de tratamiento de dichas enfermedades aumentado el nivel de TTP, así como los métodos de selección de compuestos por su capacidad para inhibir la producción de TNFα y los métodos para identificar a un individuo que se encuentre en un mayor riesgo de sufrir los efectos del exceso de TNFα.

En el documento WO 01/12213 se proporcionan métodos para regular la destrucción de moléculas de ARNm que contienen un elemento rico en AU (ARE) , por ejemplo, métodos para estimular la degradación de una molécula de ARNm que codifica TNFα y métodos para inhibir la degradación de una molécula de ARNm que codifica el factor estimulante de granulocitos y macrófagos para el tratamiento de la granulocitopenia.

Hasta ahora se desconocía la función de la TTP en un individuo en riesgo o que sufre una afección que puede mejorarse, al menos en parte, aumentado la producción de TNFα, que incluye, aunque sin limitaciones, enfermedades cardiacas y/o lesiones cardiacas.

Resumen de la invención Un objetivo de la presente invención es proporcionar ensayos de cribado para seleccionar compuestos por su capacidad para aumentar la producción de TNFα.

Un objetivo adicional de la presente invención es el uso de un ADNc o un ARNc complementario al ARNm de TTP, en el que dicho ADNc o ARNc se une al ARNm de TTP e inhibe su traducción, o un anticuerpo anti-TTP que se une específicamente a TTP y que inhibe la unión de TTP al ARNm de TNFα o fragmentos de dichos anticuerpos seleccionados entre el grupo compuesto por F (ab') 2, F (ab) 2, Fab', Fab, fragmentos Fv, proteínas scFv, fragmentos monovalentes Fab' 3.5S y péptidos de CDR para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cardiacas y/o lesiones cardiacas seleccionadas entre el grupo compuesto por sobrecarga hemodinámica, lesión por reperfusión miocárdica, cardiomiopatía hipertrófica, insuficiencia cardiaca congestiva en fase terminal, infarto de miocardio y angina inestable, y medicamentos que comprenden estos compuestos.

Una realización de la presente invención... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección de un compuesto por su capacidad para aumentar la producción del factor de necrosis tisular α (TNFα) inhibiendo y/o revirtiendo la unión de la tristetraprolina (TTP) al ARNm de TNFα, que comprende:

a) poner en contacto el compuesto con una muestra sin células que contenga ARNm de TNFα o con una muestra sin células que contenga una construcción de expresión capaz de expresar parte de la región 3' no traducida del ARNm de TNFα que abarca los fragmentos conocidos de elementos ricos en AU (ARE) que se sabe desestabilizan el ARNm de TNF-α fusionado a un gen indicador en presencia de TTP en condiciones que permitan la expresión de la proteína indicadora, y b) determinar el nivel de expresión de TNFα o de la proteína indicadora y comparar dicho nivel con el nivel de expresión obtenido en ausencia del compuesto y c) seleccionar compuestos que potencien la expresión de la proteína indicadora en comparación con el nivel de expresión obtenido en ausencia del compuesto.

2. Un método para la detección de un compuesto por su capacidad para aumentar la producción del TNFα inhibiendo y/o revirtiendo la unión de TTP al ARNm de TNFα, que comprende:

a) poner en contacto el compuesto con una línea celular que exprese TTP y TNFα o, en lugar de TNFα, una parte de la región 3' no traducida del ARNm de TNFα que abarque los fragmentos ARE que se sabe desestabilizan el ARNm de TNF-α fusionado a un gen indicador y b) determinar el nivel de expresión de TNFα o de la proteína indicadora y comparar dicho nivel con el nivel de expresión obtenido en ausencia del compuesto y c) seleccionar compuestos que potencien la expresión de TNFα o la expresión de la proteína indicadora en comparación con el nivel de expresión obtenido en ausencia del compuesto.

3. Uso de un ADNc o un ARNc complementario al ARNm de TTP, en el que dicho ADNc o ARNc se une al ARNm de TTP e inhibe su traducción, o un anticuerpo anti-TTP que se une específicamente a TTP e inhibe la unión de TTP al ARNm de TNFα o fragmentos de dichos anticuerpos seleccionados entre el grupo compuesto por F (ab') 2, F (ab) 2, Fab', Fab, fragmentos Fv, proteínas scFv, fragmentos monovalentes Fab' 3.5S y péptidos de CDR para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cardiacas y/o lesiones cardiacas seleccionadas entre el grupo compuesto por sobrecarga hemodinámica, lesión por reperfusión miocárdica, cardiomiopatía hipertrófica, insuficiencia cardiaca congestiva en fase terminal, infarto de miocardio y angina inestable.

4. Un medicamento para el tratamiento de enfermedades cardiacas y/o lesiones cardiacas seleccionadas entre el grupo compuesto por sobrecarga hemodinámica, lesión por reperfusión miocárdica, cardiomiopatía hipertrófica, insuficiencia cardiaca congestiva en fase terminal, infarto de miocardio y angina inestable, que consta de al menos un ADNc o un ARNc complementario al ARNm de TTP, uniéndose dicho ADNc o ARNc al ARNm de TTP e inhibiendo la traducción del ARNm de TTP o un anticuerpo anti-TTP que se une específicamente a TTP e inhibe la unión de TTP al ARNm de TNFα o fragmentos de dichos anticuerpos seleccionados entre el grupo compuesto por F (ab') 2, F (ab) 2, Fab', Fab, fragmentos Fv, proteínas scFv, fragmentos monovalentes Fab' 3.5S y péptidos de CDR y, opcionalmente, un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.