Un procedimiento in vitro para provocar la autolisis de una población de bacterias gramnegativas,

comprendiendo dicho procedimiento la administración a la población de un anticuerpo contra una lactona o una molécula de señalización derivada de la lactona secretada por las bacterias gramnegativas, de forma que se provoque un desequilibrio en la proporción de la molécula de señalización de homoserina lactona (HL) y la molécula de señalización de señal de quinolona (QS) en el entorno de la población de las bacterias gramnegativas.

Procedimientos para inducir autolisis en bacterias infecciosas Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para causar la autolisis de una población de bacterias gramnegativas. La desvelación prevé la aplicación de terapias basadas en moléculas receptoras de inmunoglobulinas o similares a inmunoglobulinas que tienen afinidad y especificidad por moléculas de señalización de acil homoserina lactona implicadas en los procesos de la comunicación bacteriana de célula a célula. Mediante la unión a dichas moléculas, los receptores pueden usarse para modular las concentraciones extracelulares de las moléculas implicadas en la sensibilidad al entorno y la virulencia de Pseudomonas aeruginosa, y al hacerlo pueden inducir un proceso de muerte celular rápida (autolisis) en las poblaciones bacterianas.

Antecedentes de la invención

Una de las principales causas de mortalidad y morbilidad entre los pacientes que están bajo tratamiento en los hospitales hoy en día es debida a infecciones nosocomiales. La susceptibilidad a dichas infecciones puede ser el resultado de una enfermedad primaria por la que el paciente fue hospitalizado, de regímenes de tratamientos inmunodepresores, o como consecuencia unas de lesiones que provocan daños graves en la piel, tales como quemaduras. La bacteria a la cual se atribuyen la mayoría de los casos es Pseudomonas aeruginosa. Es el arquetipo del patógeno oportunista en seres humanos. La bacteria no infecta prácticamente nunca tejidos sanos, aunque no hay ningún tejido que no pueda infectar si las defensas tisulares están comprometidas de alguna manera. Aunque supone un número de especies relativamente pequeño, presenta una seria amenaza para la salud humana y se usa a continuación como un ejemplo representativo de una bacteria infecciosa, y no limita en modo alguno el ámbito o la extensión de la presente invención.

Ps. aeruginosa es un patógeno oportunista que provoca infecciones del tracto urinario, infecciones del sistema respiratorio, dermatitis, infecciones de tejidos blandos, bacteriemias y diversas infecciones sistémicas, particularmente en las víctimas de quemaduras severas, y en pacientes oncológicos y con SIDA que están inmunodeprimidos. Las infecciones respiratorias provocadas Ps. aeruginosa se producen prácticamente exclusivamente en individuos con un tracto respiratorio inferior comprometido o con un mecanismo de defensa sistémica comprometido. La neumonía primaria se produce en pacientes con enfermedades pulmonares crónicas e insuficiencia cardiaca congestiva. La neumonía bacteriémica se produce habitualmente en pacientes oncológicos neutropénicos bajo tratamiento con quimioterapia. La colonización del tracto respiratorio inferior de pacientes con fibrosis quística por cepas mucoides de Ps. aeruginosa es habitual y difícil, si no imposible, de tratar. Provoca una bacteriemia principalmente en pacientes inmunodeprimidos. Las condiciones predisponentes incluyen enfermedades hematológicas malignas, inmunodeficiencia relacionada con el SIDA, neutropenia, diabetes mellitus y quemaduras graves. La mayoría de las bacteriemias por Pseudomonas se adquieren en los hospitales y clínicas, lo que supone aproximadamente el 25 por ciento de todas las bacteriemias gramnegativas nosocomiales.

La bacteria es conocida por su resistencia natural a muchos antibióticos debido a la barrera de permeabilidad proporcionada por sus LPS de la membrana exterior, y por lo tanto, es un patógeno particularmente peligroso y temible. También, su tendencia a colonizar superficies en forma de biopelícula hace que las células sean impermeables a las concentraciones terapéuticas de antibióticos. Dado que su hábitat natural es el suelo, al vivir en asociación con bacilos, actinomicetos y mohos, ha desarrollado resistencia a varios de sus antibióticos naturales. Además, las especies de Pseudomonas mantienen plásmidos de resistencia a antibióticos, tanto factores de resistencia (Resistance factors, R-factors) como factores de transferencia de la resistencia (Resistance Transfer Factors, RTFs) , y son capaces de transferir estos genes mediante procesos bacterianos de transducción y conjugación. Sólo unos pocos antibióticos son eficaces frente a Pseudomonas, incluyendo fluoroquinolona, gentamicina e imipenem, e incluso estos antibióticos no son eficaces frente a todas las cepas. Se ha informado de que las combinaciones de gentamicina y carbenicilina son eficaces en pacientes con infecciones agudas por Ps. aeruginosa. La futilidad del tratamiento de infecciones por Pseudomonas con antibióticos se ilustra más significativamente en pacientes con fibrosis quística, prácticamente todos los cuales se infectan con una cepa que es tan resistente que no puede ser tratada. Debido a la resistencia a los antibióticos, son obligatorias las pruebas de susceptibilidad de las cepas clínicas.

Ps. aeruginosa puede aislarse habitualmente a partir de suelo y agua, así como de superficies de plantas y animales. Se encuentra en todo el mundo, en cualquier sitio en el que aparezcan estos hábitats, por lo que es una bacteria bastante "cosmopolita". A veces está presente como parte de la flora normal de seres humanos, aunque la prevalencia de la colonización de individuos sanos fuera del hospital es relativamente baja (se estima en el intervalo de desde el 0 al 24 por ciento, dependiendo de la localización anatómica) . Se sabe que en los hospitales colonizan los alimentos, lavabos, grifos, fregonas, equipos de respiración e instrumentos quirúrgicos. Aunque la colonización precede habitualmente a las infecciones por Ps. aeruginosa, a menudo no están claras la fuente exacta y la forma de transmisión del patógeno debido a su presencia ubicua en el entorno. De entre los pacientes de cuidados intensivos en los que se sospecha infección por signos clínicos, tantos como el 50% no tienen una fuente identificable de infección. Actualmente hay 1.400 muertes en todo el mundo provocadas cada día por Ps. aeruginosa

en unidades de cuidados intensivos (UCI) , lo que le hace el asesino Nº 1.

Ps. aeruginosa es principalmente un patógeno nosocomial. Según los CDC, la incidencia global de las infecciones por Ps. aeruginosa en los hospitales de EE.UU. supone aproximadamente el 0, 4 por ciento (4 de cada 1.000 descargas) , y la bacteria es el cuarto patógeno nosocomial más comúnmente aislado, suponiendo el 10, 1% de todas las infecciones nosocomiales. Globalmente es responsable del 16% de los casos de neumonía nosocomial, del 12% de las infecciones adquiridas del tracto urinario, del 8% de las infecciones de heridas quirúrgicas y del 10% de las septicemias. Los pacientes inmunodeprimidos, tales como los pacientes oncológicos neutropénicos y los trasplantados de médula ósea, son susceptibles a la infección oportunista por Ps. aeruginosa, produciendo el 30% de las muertes declaradas. También es responsable del 38% de las neumonías asociadas a ventilación mecánica y del 50% de las muertes entre pacientes de sida. En los casos de quemaduras, las infecciones por Ps. aeruginosa han disminuido en los últimos años debido a una mejora en los tratamientos y a cambios en la dieta. Las tasas de mortalidad permanecen sin embargo elevadas, suponiendo el 60% de todas las muertes debidas a una infección secundaria en pacientes con quemaduras.

Una razón de la versatilidad de Ps. aeruginosa es que produce un conjunto diverso de determinantes de virulencia que incluyen elastasa, proteasa LasA, proteasa alcalina, ramnolípidos, motilidad por espasmos mediada por pilus de tipo IV, pioverdina (Williams y col., 1996, Stintzi y col., 1998, Glessner y col., 1999) , piocianina (Brint & Ohman, 1995, Reimmann y col., 1997) y las lectinas citotóxicas PA-I y PA-II (Winzer y col., 2000) . Ahora se sabe que muchos de estos determinantes de virulencia están regulados a nivel genético de una forma dependiente de la densidad a través de autoinducción. Ps. aeruginosa posee dos sistemas de autoinducción bien caracterizados, a saber, los sistemas las y rhl (vsm) , que forman parte de los homólogos de LuxRI LasRI (Gambello & Iglewski, 1991) y RhlRI (VsmRI) (Latifi y col., 1995) , respectivamente. LasI dirige la síntesis de 3-oxo-C12-HSL (Passador y col., 1993, Pearson y col., 1994) , mientras que RhII dirige la síntesis de C4-HSL (Winson y col., 1995) . Se cree que los sistemas las y rhl existen en una jerarquía en la que el sistema las ejerce el control transcripcional sobre RhlR (Williams y col., 1996, Pesci y col., 1997) . El activador de la transcripción LasR funciona junto 3-oxo-C12-HSL para regular la expresión de los genes que codifican para los determinantes de virulencia elastasa, proteasa... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro para provocar la autolisis de una población de bacterias gramnegativas, comprendiendo dicho procedimiento la administración a la población de un anticuerpo contra una lactona o una molécula de señalización derivada de la lactona secretada por las bacterias gramnegativas, de forma que se provoque un desequilibrio en la proporción de la molécula de señalización de homoserina lactona (HL) y la molécula de señalización de señal de quinolona (QS) en el entorno de la población de las bacterias gramnegativas.

2. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 1, en el que la molécula de señalización de homoserina lactona (HL) es una molécula de homoserina lactona con una fórmula elegida del grupo que consiste en:

en las que n = desde 0 hasta 12.

3. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 2, en el que la molécula de homoserina lactona de fórmula general (I) es N-butanoil-L-homoserina lactona (BHL) en la que n = 0, N-dodecanoil-L-homoserina lactona (dDHL) , en la que n = 8 y n-tetradecanoil-L-homoserina lactona (tDHL) en la que n = 10.

20 4. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 2, en el que la molécula de homoserina lactona de fórmula general (II) es N- (-3-oxododecanoil) -L-homoserina lactona (OdDHL) en la que n = 8 o N- (-3-oxohexanoil) -Lhomoserina lactona (OHHL) en la que n = 2.

5. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 2 en el que la molécula de homoserina lactona de fórmula general (III) es N- (-3-hidroxibutanoil) -L-homoserina lactona (HBHL) en la que n = 0.

25 6. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 2, en el que la molécula de señalización de lactona es OdDHL y/o BHL.

7. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la molécula de señalización de señal de quinolona (QS) es una molécula de fórmula general (IV) :

en la que n es desde 1 hasta 7, R1 es =O, o -H, R2 es -OH, o -H, y R3 es -H, o alternativamente, el átomo de nitrógeno (N) no está sustituido.

8. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 7, en el que la molécula de señal de quinolona de fórmula general (IV) es 2-acil-3-hidroxi-4-quinolona 9. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 8, en el que la 2-acil-3-hidroxi-4-quinolona es 2-heptil-310 hidroxi-4-quinolona.

10. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la bacteria gramnegativa es Pseudomonas aeruginosa y la proporción de las moléculas de señalización es molécula de señalización de acil-homoserina lactona (AHL) de fórmula (I) y molécula de señalización de señal de quinolona (PQS) de Pseudomonas.

11. Un procedimiento según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que los anticuerpos son anticuerpos monoclonales o policlonales, o fragmentos de los mismos.

12. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 11 en el que los fragmentos de anticuerpos son 20 fragmentos de anticuerpos de cadena única (scAbs) .

13. Un procedimiento según se reivindica en la reivindicación 12, en el que los anticuerpos de cadena única (scAbs) son G3H5, G3B12, G3G2 y/o G3H3 depositados como NCIMB-41167, NCIMB-41168, NCIMB-41169, NCIMB-41170, respectivamente.