Un polipéptido de IL-7 hiperglicosilado de mamífero purificado,

en el que dicho polipéptido de IL-7 hiperglicosilado contiene al menos tres restos aminoácidos glicosilados, tiene un punto isoeléctrico medio menor que 6,5 y un peso molecular medio mayor que 27 KDa, según se determina mediante una electroforesis en gel de SDS.

IL-7 glicosilada, su preparación y sus usos La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos de interleuquina-7 mejorados, así como a composiciones que los comprenden, a su preparación y a sus usos. La invención se refiere, más en concreto, a polipéptidos de IL-7 hiperglicosilados que tienen propiedades mejoradas, así como a su fabricación y a sus usos terapéuticos. En la presente se describen nuevos polipéptidos de IL-7 que tienen secuencias de aminoácidos modificadas que contienen un sitio o sitios de glicosilación creados artificialmente, así como las correspondientes moléculas de ácidos nucleicos, vectores y células hospedantes u hospedantes recombinantes. También se describe el uso de dichos polipéptidos, células o ácidos nucleicos para el tratamiento curativo o preventivo de sujetos mamíferos, incluyendo sujetos humanos.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos B y T son las principales células efectoras de las respuestas inmunológicas. Ambas clases celulares se considera que derivan en último término de células pluripotenciales hematopoyéticas en la médula ósea de mamíferos, a través de células progenitoras o precursoras que representan etapas distinguibles en la diferenciación de cada clase. Las células T maduras se desarrollan principalmente en el timo, supuestamente a partir de una célula precursora que migra desde la médula ósea hacia el timo en una etapa temprana del desarrollo de los linfocitos T. El desarrollo de células linfoides depende de factores del crecimiento, de supervivencia y de diferenciación producidos por diversas células estromáticas. Existe una serie de factores que están activos en las células T y B periféricas maduras, incluyendo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, interferón-gamma, BSF-2, neuroleuquina, factor del crecimiento transformante-beta e IL-7.

La "interleuquina-7" o "IL-7" se refiere a una glicoproteína secretora endógena de mamífero que es capaz de inducir la proliferación de progenitores y precursores de linfocitos derivados de la médula ósea, incluyendo los precursores especializados conocidos como células pre-B. Derivada originariamente del elemento estromático de una línea de células de la médula ósea, la IL-7 también es segregada por células estromáticas tímicas, células intestinales y otras células epiteliales, algunas células dendríticas y células dendríticas foliculares, queratinocitos y, en general, todos los tejidos linfoides. Otras denominaciones de esta molécula son "factor del crecimiento de células pre-B" y "linfopoyetina-1".

El documento EP 0314415 (o el documento US 4.965.195) describe proteínas de interleuquina-7 de mamífero y los correspondientes ADN. La secuencia de aminoácidos de la IL-7 humana contiene tres sitios de glicosilación Nenlazados putativos, localizados en los restos Asn en las posiciones 70, 91 y 116. La expresión recombinante transitoria de hIL-7 (IL-7 humana) en células COS permite la visualización de r-huIL-7 (IL-7 humana recombinante) como tres bandas de proteínas con un peso molecular aparente de aproximadamente 20, 24 y 28 kDa (Cosman et al., Lymphokine Receptor Interactions, 1989, 179:229-236) . También se ha indicado la expresión recombinante estable de hIL-7 en células BHK (Armitage et al., The Journal of Immunology, 1990, 144:938-941) . Sin embargo, el estado de glicosilación de la IL-7 humana natural, en particular el estado de O-glicosilación, nunca se ha documentado ni estudiado, y el impacto del perfil de glicosilación sobre las propiedades de IL-7 nunca se ha considerado. Además, la IL-7 humana madura no glicosilada (r-hIL-7) producida en E. coli, según se describe en el documento EP 0314415, muestra un peso molecular de 17.387 Daltons y una alta actividad in vitro en bioensayos específicos basados en la proliferación de diversas poblaciones de linfocitos. Otras citoquinas y factores del crecimiento, tales como G-CSF, GM-CSF, IFN, HGF, etc., también muestran una actividad terapéutica completa sin glicosilación.

El documento WO 2004/018681 describe un confórmero activo de la IL-7 humana, que comprende los siguientes puentes disulfuro: 1-4 (C2-C92) , 2-5 (C34-C129) , y 3-6 (C47-C141) , así como métodos para su producció o su caracterización y sus usos.

La IL-7 se describió originariamente como una citoquina cuya principal actividad era la inducción de la proliferación de células B precursoras (Namen, A.E., et al., Journal of Experimental Medicine, 1988, 167:988-1002) . La IL-7 se ha descrito en fechas más recientes como implicada en la supervivencia y la proliferación de timocitos (células T) durante la etapa temprana del desarrollo de células T (Schluns, K.S., et al., Nature Immunology, 200, 1 (5) :426-432) . La vía de la IL-7 es fundamental para el desarrollo de linfocitos, especialmente sobre los timocitos en desarrollo (Maeurer, M.J., et al., Int. Rev. Immunol., 1988, 16:309-322; Fr y , T.J., et al., Blood, 2002, 99:3892-3904) . Fr y y colaboradores también identificaron a la IL-7 como un potente modulador de la regeneración de células T independiente del timo en una acción multifactorial (Fr y , T.J., et al., Blood, 2001, 97 (6) :1525-1533) . La IL-7 modula potentemente a las células T maduras, y además de este efecto sobre las células T maduras, la IL-7 puede influir en el desarrollo de las células presentadoras de antígenos (Márquez, C., et al., J. Exp., Med., 1995, 181:475-483) . La IL-7 es fundamental para la regeneración de las células T de memoria, en ambos subconjuntos CD4+ y CD8+ (Kondrack, R.M., et al., J. Exp. Med., 2003, 198:1797-1806; Kaech, S.M., et al., Nat. Immunol, 2003, 4:1191-1198) .

Por tanto, la IL-7 tiene un gran potencial terapéutico para su uso en la estimulación de la proliferación de precursores de las células T, de células B secretoras de anticuerpos, en la estimulación de la expansión periférica de células T dirigida por antígenos, y en la producción de células T no estimuladas, así como otros tipos de células hematopoyéticas. Un uso terapéutico particularmente interesante de las moléculas de IL-7 activas es para la reconstitución inmunológica de pacientes linfopénicos: pacientes tratados de un cáncer, pacientes que han recibido una transferencia de médula ósea o de células pluripotenciales, pacientes que presentan una inmunodeficiencia genética o adquirida, pacientes ancianos o cualquier paciente que tenga un recuento bajo de CD4. Otras utilidades residen en la capacidad de la IL-7 para producir nuevas células T CD4 no estimuladas, o para expandir agrupaciones específicas, para producir o aumentar las respuestas inmunológicas específicas (potenciación de vacunas) .

En vista de sus potenciales terapéuticos, existe un considerable interés en el desarrollo de polipéptidos de IL-7 mejorados o biológicamente activos que sean adecuados para unos usos terapéuticos eficaces. A este respecto, entre las diversas citoquinas y factores del crecimiento disponibles en el mercado, algunos son muy poco inmunogénicos (por ejemplo, el interferón-alfa "IFNa", el factor estimulante de colonias de granulocitos "G-CSF") , de forma que las correspondientes sustancias farmacológicas no requieren una pureza polipeptídica muy específica aparte del nivel convencional normalmente aceptado para las proteínas recombinantes. En contraste, otros factores del crecimiento son más inmunogénicos (por ejemplo, el beta-interferón "1-IFN", el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos "GM-CSF") , o su actividad específica es tan crítica para la vida (por ejemplo, la eritropoyetina "EPO") que el perfil y la pureza polipeptídica de la sustancia farmacológica debe estudiarse de modo específico y mantenerse dentro de unos límites estrechos para protegerlas de la inmunogenicidad.

La IL-7 es una molécula excepcional. Debido sus propiedades inmunopotenciadoras intrínsecas, la IL-7 utilizada como agente terapéutico es particulamente propensa a activar una inmunogenicidad anti-IL-7 (anticuerpos anti-IL-7 neutralizantes o de unión a IL-7) . Esta inmunogenicidad es perjudicial para la actividad terapéutica a largo plazo de la proteína. Los anticuerpos anti-IL-7 pueden modificar la farmacocinética de la IL-7 y neutralizar su actividad terapéutica.

Diversas isoformas de IL-7 están implicadas en la activación de la inmunogenicidad anti-IL-7, entre las cuales se encuentran secuencias polipeptídicas alteradas (por ejemplo, formas oxidadas, reducidas, desamidadas o truncadas) , múltimeros de IL-7 covalentes o no covalentes, tales como moléculas de IL-7 agregadas, y similares. Por tanto, resulta fundamental definir polipéptidos y sustancias farmacológicas de IL-7 que sean... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de IL-7 hiperglicosilado de mamífero purificado, en el que dicho polipéptido de IL-7 hiperglicosilado contiene al menos tres restos aminoácidos glicosilados, tiene un punto isoeléctrico medio menor que 6, 5 y un peso molecular medio mayor que 27 KDa, según se determina mediante una electroforesis en gel de SDS.

2. Una composición de IL-7 hiperglicosilada, en la que dicha composición comprende al menos 80% de polipéptidos de IL-7 de mamífero que tienen al menos tres restos aminoácidos glicosilados, un punto isoeléctrico medio menor que 6, 5 y un peso molecular medio mayor que 27 KDa, según se determina mediante una electroforesis en gel de SDS.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que dicha composición comprende entre 80% y 95% polipéptidos de 10 IL-7 de mamífero que están N-glicosilados en al menos tres restos aminoácidos diferenciados.

4. La composición de la reivindicación 2 ó 3, que comprende al menos 80% de polipéptidos de IL-7 de mamífero que están glicosilados en tres a ocho restos aminoácidos diferenciados, incluyendo un sitio de O-glicosilación y hasta siete sitios de N-glicosilación.

5. La composición de la reivindicación 4, que comprende entre 80% y 95% de polipéptidos de IL-7 de mamífero que

están glicosilados en tres a ocho restos aminoácidos diferenciados, incluyendo un sitio de O-glicosilación y hasta siete sitios de N-glicosilación.

6. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que el polipéptido de IL-7 de mamífero es un polipéptido de IL-7 humano.

7. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en la que el polipéptido de IL-7 de mamífero es 20 un polipéptido de IL-7 canino.

8. La composición o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los sitios de glicosilación están presentes en la naturaleza y/o se crean artificialmente en la secuencia del polipéptido de IL-7.

9. La composición o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el polipéptido de IL-7 de mamífero es un polipéptido de IL-7 humano, y en el que los sitios de glicosilación se seleccionan de los restos Asn

en las posiciones 70, 91 y 116; Thr en la posición 110, así como cualquier sitio de glicosilación creado artificialmente según se lista en la siguiente tabla:

y preferiblemente según se lista en la siguiente tabla:

o sus combinaciones.

10. La composición o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichos polipéptidos de IL-7 comprenden o están enriquecidos en carbohidratos N-enlazados seleccionados de:

a) una cadena de azúcar de tipo mamífero, preferiblemente del tipo expresado por las células CHO;

b) una cadena de azúcar que comprende una cadena de N-carbohidrato compleja (por ejemplo, una estructura triantenaria o biantenaria) , que más preferiblemente contiene un alto contenido en moléculas de manosa y acetilglucosamina y gran cantidad de restos ácido siálico terminales;

c) una cadena de azúcar sialilada por alfa-2, 6-sialiltransferasa o alfa-2, 3-sialiltransferasa; y/o d) una cadena de azúcar sialilada que presenta entre 3 y 30 sialil-N-acetilgalactosamina, preferiblemente de 7 a 23.

11. La composición o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dichos polipéptidos de IL-7 comprenden o están enriquecidos en una cadena o cadenas de carbohidratos O-enlazados con un resto ácido siálico terminal.

12. La composición o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la cadena o cadenas de carbohidratos comprenden estructuras tetraanterias a biantenarias con una sialilación terminal parcial o completa, más preferiblemente una estructura triantenaria y una tri- o bisialilación y/o una estructura diantenaria con una disialilación.

13. La composición o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dichos polipéptidos de IL-7 hiperglicosilados muestran una semivida y un tiempo medio de residencia extendidos in vivo en un hospedante mamífero.

14. La composición o el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dichos polipéptidos de IL-7 hiperglicosilados comprenden los siguientes tres puentes Cys: 1-4 (Cys2-Cys92) ; 2-5 (Cys34-Cys129) ; 3-6 (Cys47-Cys141) .

15. La composición o el polipéptido de la reivindicación 14, en el que dicho polipéptido de IL-7 hiperglicosilado es un polipéptido de SEQ ID NO:1.

16. Un método para producir un polipéptido de IL-7 según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende:

a) cultivar, en un modo de alimentación discontinua o por perfusión, una célula hospedante recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de IL-7, b) recoger el polipéptido de IL-7 producido a partir de dicha célula, y c) purificar dicho polipéptido de IL-7 mediante un método que comprende al menos una etapa de una cromatografía de interacción hidrófoba, una cromatografía de intercambio iónico, una cromatografía de afinidad o una cromatografía de filtración en gel, por sí solas o en diversas combinaciones.

17. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido o una composición de IL-7 según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente compatibles.

18. Un polipéptido o una composición de IL-7 hiperglicosilada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para su uso para provocar o modular una respuesta inmunológica en un sujeto.

19. El polipéptido o la composición de IL-7 hiperglicosilada de la reivindicación 18, para su uso para inducir una estimulación de la linfopoyesis prolongada y/o para amplificar una respuesta inmunológica.

20. El polipéptido o la composición de IL-7 hiperglicosilada de la reivindicación 18, para su uso para tratar una infección vírica, tal como una infección por VIH, hepatitis vírica, fiebre del Nilo occidental, dengue.

21. El polipéptido o la composición de IL-7 hiperglicosilada de la reivindicación 20, en el que el polipéptido de IL-7 hiperglicosilado se administra en asociación con una molécula de interferón.

22. El polipéptido o la composición de IL-7 hiperglicosilada de la reivindicación 18, para su uso para mejorar la recuperación timopoyética en un sujeto inmunocomprometido.

23. El polipéptido o la composición de IL-7 hiperglicosilada de la reivindicación 22, en el que el polipéptido de IL-7 hiperglicosilado se administra en asociación con un factor del crecimiento de queratinocitos, un factor de células pluripotenciales, un antagonista de gonadoestimulina o una hormona del crecimiento.

24. El polipéptido o la composición de IL-7 hiperglicosilada de la reivindicación 18, en el que el polipéptido de IL-7 hiperglicosilado se administra en asociación con un antígeno o una mezcla de antígenos, para proporcionar una inmunización terapéutica contra células malignas, virus o bacterias.

25. El polipéptido o la composición de IL-7 hiperglicosilada de la reivindicación 24, en el que el polipéptido de IL-7 hiperglicosilado se administra también en asociación con GM-CSF.