PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN DE ANIMALES VACUNADOS FRENTE A BRUCELLA.

Procedimiento de identificación de animales vacunados frente a Brucella.

La presente invención se refiere al uso de una cepa de Brucella spp. que expresa la proteína Green Flourescent Protein (GFP) en la elaboración de medicamentos para la prevención de la brucelosis en mamíferos, a las vacunas frente a la brucelosis, y al método para la identificación de los mamíferos a los que se les ha administrado dichas vacunas. Preferiblemente, el método de la invención es un inmunoensayo, y aún más preferiblemente es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Procedimiento de identificación de animales vacunados frente a Brucella.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la Medicina Preventiva y Salud Pública, y se refiere tanto al desarrollo y utilización de vacunas vivas de Brucella spp. modificadas genéticamente, como al desarrollo y utilización de técnicas de diagnóstico directo e indirecto que permiten la identificación de animales que han sido vacunados de aquellos que padecen una infección por cepas virulentas de Brucella spp.

Estado de la técnica anterior

La brucelosis es una enfermedad que se transmite de los animales al hombre. En los animales, la infección por Brucella causa abortos, infertilidad, disminución de las producciones y limitaciones en el comercio de animales y productos derivados, lo que constituye un problema de Sanidad Animal con repercusiones económicas. Además, la bacteria se transmite de los animales infectados a los seres humanos, produciéndoles una enfermedad debilitante y a menudo invalidante, frente a la que no existen vacunas y cuyo tratamiento requiere de altas dosis de antibióticos durante periodos prolongados, con frecuentes recidivas. Por lo tanto, la brucelosis constituye un problema de Salud Pública relevante. Se ha demostrado que la prevalencia de la brucelosis humana está directamente relacionada con la prevalencia de la brucelosis animal. Por ello y en ausencia de vacunas para uso en humanos, la prevención de la enfermedad pasa necesariamente por el control de la infección en los animales. En la mayoría de los contextos socio-económicos, la única forma viable de controlar la brucelosis es mediante programas basados en la vacunación de los animales de producción, bien mediante programas de vacunación masiva o mediante programas de vacunación, diagnóstico y sacrificio de los animales infectados (Blasco 1997. Preventive Veterinar y Medicine 31: 275283) .

Las vacunas de referencia contra la brucelosis animal son B. abortus S19 (lisa) para ganado vacuno y B. melitensis Rev1 (lisa) para ganado ovino y caprino (OIE Terrestrial Manual, 2009 -capítulos 2.4.3. y 2.7.2. ) . Ambas son vacunas vivas atenuadas, libres de adyuvantes, con bajo coste de producción y adquisición, y altamente eficaces frente a las infecciones por cepas de campo en rumiantes (principal fuente de infección para los humanos) . Sin embargo, presentan el inconveniente técnico de generar una respuesta inmune, tras la vacunación, indistinguible de la inducida tras la infección virulenta por cepas de campo. Para solucionar este problema, se han realizado numerosos esfuerzos científicos. Una de las estrategias ha sido el desarrollo de cepas rugosas (R) de Brucella que, al carecer de la cadena O del lipopolisacárido (LPS) -conocido factor de virulencia de Brucella y principal antígeno utilizado en los ensayos de diagnóstico serológico de la infección-ha permitido obtener cepas atenuadas utilizables como vacunas vivas, que no interfirieren significativamente en las pruebas de diagnóstico serológico. En este contexto, en los años 90, se desarrolló (mediante subcultivos) el mutante espontáneo con fenotipo R denominado B. abortus RB51 (Schurig et al., 1991. Veterinar y Microbiology, 28: 171-188) . La cepa RB51 se está utilizando actualmente en algunos países contra la brucelosis bovina, con resultados controvertidos. Tanto RB51 como una colección de mutantes R derivados de B. melitensis y genéticamente bien caracterizados en las distintas rutas de síntesis del lipopolisacárido (González et al., 2008. PloS One, 3 (7) : e2760) , reducen los problemas de interferencia en el diagnóstico serológico de la infección virulenta, al carecer de antígeno “O”. Sin embargo, se ha demostrado que las vacunas R no solucionan el problema, ya que la protección que confieren frente a las infecciones de campo es muy inferior a la de las vacunas de referencia B. abortus S19 y B. melitensis Rev1 (Moriyón et al., 2005. Veterinar y Research, 35:1-38; Barrio et al., 2009. Vaccine, 27: 1741-1749) . Por todo ello, se hace imprescindible disponer de vacunas derivadas B. abortus S19 y B. melitensis Rev1 modificadas genéticamente y de pruebas de diagnóstico asociadas que permitan diferenciar mediante diagnóstico directo e indirecto (serología) a los animales que han sido vacunados de aquellos que padecen la infección virulenta.

Existe una gran variedad de proteínas fluorescentes GFP (Green Flourescent Protein) , que se generan en cantidad y con intensidad de fluorescencia variables, según el sistema de expresión utilizado. Las proteínas GFP han sido ampliamente utilizada en Biología Molecular y Celular para mareaje genético y detección de microorganismos (incluyendo Brucella; Celli et al., 2003. Journal of Experimental Medicine, 198 (4) : 545-556) células, plásmidos, proteínas recombinantes y otros elementos con fines estrictamente científicos. Asimismo, se han desarrollado algunas pruebas inmunológicas tipo immunoblotting (Rajasekaran et al., 2008. Applied and Environmental Microbiology, 74 (22) : 7051-7055) y ELISA sándwich para la detección y cuantificación de diversas proteínas GFP expresadas en microorganismos, células y tejidos (Cell Biolabs, Inc.; Cell Signaling Technology, Inc.) . También existen ensayos de diagnóstico molecular tipo PCR para identificar determinadas variantes del gen que codifican la proteína GFP en bacterias como E. coli (Clontech Laboratories) o Staphylococcus epidermidis (Franke et al., 2007. Journal of Microbiological Methods

71: 123-132) .

Walsh y colaboradores (Walsh et al., 2000. Journal of General Virology, 81, 709-718) propusieron la posible utilización de una proteína GFP como marcador de una vacuna veterinaria. Sin embargo, no consiguieron expresarla convenientemente en el virus de la Peste Bovina.

Descripción de la invención

Los autores de la presente invención describen cómo una cepa derivada de B. abortus S19 (la vacuna prototipo S19-GFPp) , es capaz de expresar la GFP de manera estable, sin alterar las características microbiológicas o biológicas (atenuación y eficacia frente a la infección en animales de experimentación) de la cepa S19 de referencia y, además, es capaz de inducir la respuesta de anticuerpos anti-GFP detectables mediante pruebas serológicas específicas, que permiten diferenciar los hospedadores que han sido vacunados de aquellos infectados por cepas virulentas de Brucella spp. También describen un método ELISA indirecto de diagnóstico serológico capaz de identificar específicamente a los animales que han sido inmunizados con la nueva vacuna que expresa la proteína GFP.

Por lo tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de una cepa de Brucella spp. que expresa de forma estable la proteína Green Flourescent Protein (GFP) y que es capaz de provocar una respuesta inmune en el hospedador equiparable a la inducida por las cepas vacunales de referencia y además, genera anticuerpos anti-GFP detectables por métodos serológicos específicos, en la elaboración de un medicamento o, alternativamente, a una cepa de Brucella sp. que expresa de forma estable la proteína Green Flourescent Protein (GFP) y que es capaz de provocar una respuesta inmune en el hospedador equiparable a la inducida por las cepas vacunales de referencia y además, genera anticuerpos anti-GFP detectables por métodos serológicos específicos, para su uso como medicamento. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el medicamento es una vacuna.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una cepa de Brucella spp. que expresa de forma estable la proteína Green Flourescent Protein (GFP) y que es capaz de provocar una respuesta inmune en el hospedador equiparable a la inducida por las cepas vacunales de referencia y además, genera anticuerpos anti-GFP detectables por métodos serológicos específicos, en la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la brucelosis en un mamífero o, alternativamente, a una cepa de Brucella spp. que expresa de forma estable la proteína Green Flourescent Protein (GFP) y que es capaz de provocar una respuesta inmune en el hospedador equiparable a la inducida por las cepas vacunales de referencia y además, genera anticuerpos anti-GFP detectables por métodos serológicos específicos, para su uso en la prevención o el tratamiento de la brucelosis en un mamífero.

En esta memoria, se entiende por Brucella spp. cualquier organismo celular que puede ser definido como taxonómicamente perteneciente al superreino Bacteria, phylum Proteobacteria, clase Alphaproteobacteria, orden Rhizobiales, familia... [Seguir leyendo]

1. Uso de una cepa de Brucella spp. que expresa la proteína Green Flourescent Protein (GFP) en la elaboración de un medicamento.

2. Uso de una cepa de Brucella spp. según la reivindicación 1, en la elaboración de un medicamento para la prevención de la brucelosis en mamíferos.

3. Uso de una cepa de Brucella spp. según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la cepa de Brucella pertenece a la especie B. abortus.

4. Uso de una cepa de Brucella spp. según la reivindicación 3, donde la cepa de Brucella es una cepa derivada de la cepa de referencia B. abortus S19.

5. Uso de una cepa de Brucella spp. según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la cepa de Brucella pertenece a la especie B. melitensis.

6. Uso de una cepa de Brucella spp. según la reivindicación 5, donde la cepa de Brucella es una cepa derivada de la cepa de referencia B. melitensis Rev 1.

7. Uso de una cepa de Brucella spp. según cualquiera de las reivindicaciones 2-6, donde el mamífero es un rumiante.

8. Uso de una cepa de Brucella spp. según la reivindicación 7, donde el rumiante pertenece a la subfamilia Bovinae.

9. Uso de una cepa de Brucella spp. según la reivindicación 7, donde el rumiante pertenece a la subfamilia Caprinae.

10. Composición que comprende una cepa de Brucella spp. que expresa la proteína Green Flourescent Protein (GFP) según cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Composición según la reivindicación anterior que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-11, que es una vacuna.

13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que además comprende un adyuvante.

14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, que adicionalmente comprende otro principio activo.

15. Método para la identificación de mamíferos tratados con la composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-14, que comprende:

a. obtener una muestra biológica aislada del mamífero,

b. detectar la presencia del gen gfp, o de los productos de su expresión, en la muestra biológica aislada del mamífero.

16. Método para la identificación de mamíferos tratados según la reivindicación anterior, donde la muestra biológica aislada del mamífero es un fluido biológico.

17. Método para la identificación de mamíferos tratados según la reivindicación 15, donde la muestra biológica aislada del mamífero son células o tejidos.

18. Método para la identificación de mamíferos tratados según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde la detección de los productos de expresión del gen gfp en la muestra biológica aislada de mamífero se realiza mediante la detección de los anticuerpos anti-GFP.

19. Método para la identificación de mamíferos tratados según la reivindicación 18, donde la detección de los anticuerpos anti-GFP se realiza mediante inmunoensayo.

20. Método para la identificación de mamíferos tratados con la cepa o la composición según la reivindicación 19, donde el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) .

21. Método para la identificación de mamíferos tratados con la cepa o la composición según la reivindicación 20, donde el ELISA es un ELISA indirecto.

22. Método para la identificación de mamíferos tratados con la cepa o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde la detección del gen gfp, o de los productos de su expresión, se realiza por luz ultravioleta.

23. Método para la identificación de mamíferos tratados con la cepa o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 15-17 y 22, donde la detección del gen gfp, o de los productos de su expresión, se realiza por microscopía de fluorescencia.

24. Método para la identificación de mamíferos tratados con la cepa o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde la detección del gen gfp, o de los productos de su expresión, se realiza mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

25. Kit de identificación de mamíferos tratados con la cepa o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende los medios adecuados para llevar a cabo un método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 15-24.

26. Kit de identificación según la reivindicación anterior, que comprende los medios adecuados para detectar los anticuerpos anti-GFP.