Glucanos y glucopéptidos de Campylobacter.

Compuesto que comprende un heptasacárido aislado de fórmula GalNAc-α

1,4-GalNAc-α1,4-[Glc-ß1,3]GalNAcαα1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-Bac, en la que Bac es 2,4-diacetamido-2,4,6-trideoxi-D-glucopiranosa.

Glucanos y glucopeptidos de Campylobacter.

CAMP0 DE LA INVENCION

La invencion se encuentra comprendida en el campo de las glucoproteinas y fracciones de glucano de las glucoproteinas biologicamente activas, asi como vacunas, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que resultan utiles para combatir las bacterias Campylobacter.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Campylobacter es un patogeno significativo de transmision alimentaria en los productos de origen animal, entre ellos los productos avicolas. De esta manera, resulta deseable proporcionar estrategias para combatir los efectos perjudiciales en el ser humano. La eliminacion de dichos patogenos del ganado puede servir como medio para reducir la incidencia de la infeccion en el ser humano y reducir la enfermedad en animales de granja que se encuentran afectados. Las proteinas glucosiladas y en particular determinadas fracciones glucano de estos compuestos representan dianas viables para estrategias inmunologicas para reducir o eliminar la presencia de estos organismos en el ganado, con el fin de reducir el riesgo de contaminacion humana por la ingestion o manipulacion de productos animales, asi como la contaminacion por diseminacion fecal de las bacterias del estiercol de origen animal. Las glucoproteinas y fragmentos de las mismas, tales como fracciones glucano, tambien pueden proporcionar una base para vacunas y preparaciones de anticuerpos con diana en infecciones por Campylobacter.

Tambien resulta deseable proporcionar herramientas de investigacion de aplicacion general en el estudio de la glucosilacion de las proteinas. La glucosilacion de las proteinas en el pasado se habia considerado un fenomeno especificamente eucariotico, pero ahora esta claro que es un fenomeno generalizado en los dominios tanto de arqueobacterias como de eubacterias (1, 2) . Se han identificado enlaces glucosidicos de los tipos N- y 0- en un grupo diverso de organismos procarioticos con una preponderancia de azucares unidos a N aparente en las arqueobacterias, mientras que las unidades de union del tipo 0 predominan en las glucoproteinas identificadas hasta el momento en las eubacterias (1, 2) . Ademas, los enlaces N- y 0- bacterianos se forman en un abanico mas amplio de azucares que el observado en las glucoproteinas eucarioticas.

Los presentes inventores han descubierto que determinados glucopeptidos y fracciones glucano forman una base efectiva para las vacunas y anticuerpos que actuan contra multiples cepas de bacterias Campylobacter, en virtud de la presencia ubicua sobre la superficie de dichas bacterias en una forma invariante (o practicamente invariante) en multiples cepas y especies. Este glucano tambien se encuentra presente como componente de una pluralidad de glucoproteinas superficiales de Campylobacter, incrementando de esta manera su valor como diana inmunologica.

Recientemente se ha identificado un locus genico en el patogeno enterico Campylobacter jejuni, que aparentemente se encuentra implicado en la glucosilacion de multiples proteinas. Lo anterior proporciona la primera evidencia de una ruta de glucosilacion generalizada de las proteinas en una bacteria Gram-negativa (3) . La mutagenesis de los genes en este locus, denominada pgl (glucosilacion de proteinas) , resulta en la perdida de inmunogenicidad en multiples proteinas. Las fracciones glucano de dichas proteinas se ha demostrado tambien que resultan reconocidas por antisueros procedentes de voluntarios humanos infectados experimentalmente (3) . La eliminacion de las fracciones glucano por la mutacion pgl resulta en la reduccion de la adherencia e invasion in vitro y en la perdida de la colonizacion del raton in vivo (4) , sugiriendo que la glucosilacion de las proteinas influye sobre las propiedades de virulencia de este organismo.

Los oligosacaridos de Campylobacter para la utilizacion en la obtencion de anticuerpos contra las bacterias Campylobacter se describen en Schwerer et al., "Antibody Cross-reactivities Between Gangliosides and Lipopolysaccharides of Campylobacter jejuni Serotypes Associated with Guilain-Barre Syndrome", J. Endo. Res. 2 (6) :395-403, diciembre de 1995.

Los presentes inventores han identificado y caracterizado modificaciones post-traduccionales de proteinas en la cepa NCTC 11168 de C. jejuni, la cepa para la que la secuencia genomica completa ha sido descrita por Parkhill et al. (6) . Entre las proteinas que daban lugar a multiples manchas en los geles 2D se encontraba PEB3, o Cj0289c, una proteina antigenica mayor de C. jejuni descrita por primera vez por Pei et al. (7) . Al purificarse y analizarse mediante SDS-PAGE 1D, revelo dos bandas con una diferencia de masa de -1.500 Da, presentando ambas secuencias N-terminales correspondientes a la PEB3 autentica. Concurrentemente con nuestras observaciones de PEB3, Linton et al. (8) identificaron dos glucoproteinas putativas de C. jejuni mediante la utilizacion de la lectina especifica de GalNAc, aglutinina de soja, una de las cuales era PEB3, y la otra era una proteina periplasmica putativa, Cj1670c, que denominaron CgpA. Los autores tambien observaron algunas otras glucoproteinas putativas, basandose en su capacidad de unirse a la lectina, pero no las identificaron. Ademas, la union de las proteinas a la lectina tambien resulta afectada por la mutagenesis de genes en el locus de pgl. Ademas, los presentes inventores demostraron que la mutacion de un gen pglB, cuya homologia con la subunidad STT3 de la oligosacariltransferasa unida al extremo N de Saccharomyces cerevisiae sugiere una funcion en la biosintesis de glucoproteinas (3, 9) , afecta especificamente a la glucosilacion de las glucoproteinas identificadas.

Ademas, los carbohidratos participan en una diversidad de funciones en todos los dominios de la vida. Aunque en general se observa un grado elevado de variancia de las glucoproteinas y de sus dominios glucano en los glucanos superficiales antigenicos en cepas bacterianas y especies relacionadas, no siempre es asi y estas excepciones constituyen candidatos excelentes que resultan adecuados para las estrategias basadas en anticuerpos o vacunas de eliminacion de bacterias. En particular, uno de dichos carbohidratos es la fraccion glucano de las glucoproteinas de Campylobacter. Los recientes esfuerzos de los presentes inventores para caracterizar el glucoma del importante patogeno de transmision alimentaria Campylobacter jejuni, han llevado a elucidar todas las estructuras de glucano superficial, es decir, los lipooligosacaridos (L0S) , los polisacaridos capsulares (CPS) , los glucanos N-ligados y los glucanos 0-ligados (5, 12-15) .

Los presentes inventores han demostrado que el heptasacarido, que se describe en la presente memoria, es comun a por lo menos varias especies de Campylobacter y a numerosas cepas, incluyendo especies que resultan importantes como patogenos humanos y veterinarios, y es un componente multiples glucoproteinas, incluyendo las Cj n° 0114, n° 0200c, n° 0289c, n° 0367c y otras. Dichas fraccion glucano tambien es fuertemente inmunogenica y de esta manera este glucano (y fragmentos y glucopeptidos relacionados) es un buen candidato para la utilizacion como vacuna para la inmunizacion activa contra multiples cepas y especies de Campylobacter y como base para anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que resultan adecuados para el tratamiento dirigido de Campylobacter en seres humanos o en ganado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "ganado" incluye mamiferos y aves.

DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION

Es un objetivo de la invencion proporcionar un glucano que puede existir aisladamente o unido a un oligopeptido, un aminoacido y/o un conjugado inmunogenico.

Segun un aspecto, la invencion proporciona un compuesto que comprende un heptasacarido de formula I: GaINAca1, 4-GaINAc-a1, 4-[Glc-º1, 3]GaINAc-a1, 4-GaINAc-a1, 4-GaINAc-a1, 3-Bac, en el que Bac es 2, 4-diacetamido-2, 4, 6trideoxi-D-glucopiranosa. La formula I tambien incluye fragmentos inmunologicamente activos del compuesto indicado anteriormente. La expresion "inmunologicamente activo" se refiere a que dicho fragmento puede comprender el componente activo de una vacuna contra Campylobacter, o pueden proporcionarse fragmentos de anticuerpo que se unen especificamente a dicho compuesto y neutralizan Campylobacter en un organismo en el que han sido administrados. Estos glucanos pueden proporcionarse en forma aislada o unidos a un oligopeptido o aminoacido, formando un nuevo glucopeptido. El aminoacido puede comprender asparagina, formando un glucopeptido N-ligado. Estos glucanos o glucopeptidos pueden derivarse o aislarse... [Seguir leyendo]

1. Compuesto que comprende un heptasacarido aislado de formula GalNAc-a1, 4-GalNAc-a1, 4-[Glc

º1, 3]GalNAc-a1, 4-GalNAc-a1, 4-GalNAc-a1, 3-Bac, en la que Bac es 2, 4-diacetamido-2, 4, 6-trideoxi-Dglucopiranosa.

2. Compuesto segun la reivindicacion 1, unido a un aminoacido u oligopeptido.

3. Compuesto segun la reivindicacion 2, en el que dicho aminoacido es la asparagina.

4. Compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3 derivado de una glucoproteina aislada y purificada a partir de una bacteria Campylobacter.

5. Compuesto segun la reivindicacion 4, en el que dicha bacteria se selecciona de entre C. jejuni y C. coli.

6. Composicion farmaceutica que comprende un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un portador fisiologicamente aceptable.

7. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 6, que comprende ademas un conjugado inmunogenico.

8. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 6 o 7, que comprende ademas un inmunoestimulador.

9. Composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, para la utilizacion como vacuna en un animal o en un ser humano.

10. Anticuerpo o fragmento de union a antigeno de un anticuerpo, que se une especificamente al compuesto segun la reivindicacion 1.

11. Anticuerpo o fragmento de union a antigeno de un anticuerpo, que se une especificamente al compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

12. Anticuerpo o fragmento de union a antigeno de un anticuerpo, que se une especificamente al compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, derivado de un gen aislado a partir de un camelido.

13. Anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo segun la reivindicacion 12, en el que dicho camelido se selecciona de entre Camelus bactriamus, Camelus dromaderius, Lama pPaccos, Lama ggGlama y Lama vVicugna.

14. Composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo o fragmento de union a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, y un portador fisiologicamente aceptable.

15. Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 14, para la utilizacion como agente terapeutico en un ser humano o en un animal.

16. Anticuerpo o fragmento de union a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, para la utilizacion en la preparacion de una composicion para administrar en el ganado para reducir la presencia de patogenos Campylobacter en el ganado.

17. Anticuerpo o fragmento de union a antigeno segun la reivindicacion 16, en el que dicha administracion consiste de alimentar al ganado con pienso en el que se ha mezclado dicho anticuerpo o fragmento de union a antigeno.

18. Anticuerpo o fragmento de union a antigeno segun la reivindicacion 16 o 17, en el que dicho ganado son

aves

19. Anticuerpo o fragmento de union a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, para la utilizacion en la preparacion de una composicion para prevenir las infecciones por Campylobacter causadas por patogenos Campylobacter en un ser humano, mediante la eliminacion de dichos patogenos del ganado mediante la administracion de dicha composicion en dicho ganado.

20. Anticuerpo o fragmento de union a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, para la utilizacion en la preparacion de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad causada por patogenos Campylobacter en un ser humano o en un animal.

21. Metodo para prevenir la contaminacion del agua subterranea por patogenos Campylobacter, comprendiendo el metodo la reduccion de la presencia de dichos patogenos en el ganado mediante la aplicacion del compuesto segun la reivindicacion 16 para la utilizacion segun la reivindicacion 16.

22. Alimento o bebida animal para el ganado, que comprende el anticuerpo o fragmento de union a antigeno segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.

23. Alimento o bebida segun la reivindicacion 22, que comprende un aditivo que comprende dicho anticuerpo o fragmento.

24. Alimento segun la reivindicacion 23, que comprende una planta que contiene un genoma modificado para expresar dicho anticuerpo o fragmento.

25. Kit diagnostico para detectar la presencia de Campylobacter en animales o seres humanos, comprendiendo dicho kit el anticuerpo o fragmento de anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.

26. Kit diagnostico para detectar la presencia de Campylobacter en una muestra, comprendiendo dicho kit el anticuerpo o fragmento de anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.

27. Kit segun la reivindicacion 26, en el que dicha muestra se selecciona de entre agua, tierra y estiercol.