Gen regulador de la ramificación de plantas, promotores, construcciones genéticas que lo contienen y usos.

La presente invención se refiere a un gen que codifica para un factor de transcripción de la familia TCP y que tiene un papel biológico en el desarrollo y crecimiento de las ramas. También se refiere a los promotores de la transcripción de dicho gen, a las construcciones genéticas que los contienen y a sus usos para modificar la arquitectura de las plantas.

Gen regulador de la ramificación de plantas, promotores, construcciones genéticas que lo contienen y usos.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular, la biotecnología y la mejora vegetal, y específicamente se refiere a genes que codifican para factores de transcripción de la familia TCP y que tienen un papel biológico en el desarrollo de las yemas axilares y el crecimiento de las ramas. También se refiere a los promotores de la transcripción de dichos genes, a las construcciones genéticas que los contienen y a sus usos, incluyendo el empleo de agentes que modulen la expresión de estos genes, para modificar la arquitectura de las plantas.

Estado de la técnica anterior

Una de las cuestiones centrales en biología es el efecto que tiene la evolución de los genomas en la diversidad morfológica. Los planes corporales están determinados por las rutas genéticas de desarrollo ampliamente conservadas en grandes grupos taxonómicos. Cambios en la actividad de los genes que controlan estas vías, dan lugar a alteraciones en los patrones morfológicos. La mayoría de estos cambios son deletéreos, pero unos pocos pueden dar lugar a la evolución de la forma.

En las plantas angiospermas los patrones de ramificación se determinan por la posición en que se forman las ramas. Las ramas se generan a partir de meristemos formados en las axilas de las hojas tras la germinación de las semillas. Los meristemos axilares (MA) dan lugar a yemas axilares, estructuras que contienen ramas preformadas con entrenudos cortos, primordios foliares, nuevos MA y, a menudo, meristemos florales. Las yemas pueden permanecer inactivas durante largos periodos de tiempo, o brotar dando lugar a ramas por elongación de los entrenudos, en respuesta a señales ambientales o endógenas. Esta decisión determina la arquitectura de la planta y afecta a aspectos claves de la vida de la planta, tales como la cantidad de nutrientes que recibirá cada eje de crecimiento, la altura de la planta, la protección solar de los frutos, la eficiencia en la absorción de la luz o su visibilidad para los polinizadores.

Los genes que controlan la iniciación de los MA, el desarrollo de las yemas y su brotación han sido caracterizados en varias especies de angiospermas. Estos estudios indican que el desarrollo de las yemas axilares está controlado por rutas genéticas conservadas que evolucionaron antes de la radiación de las plantas con flores. La iniciación de MA está controlada por los genes Ls/LAS/MONOCULM1 y los genes Blind/RAX1 en tomate (Solanum lycopersicum) , Arabidopsis, y arroz. La auxina y la estrigolactona, hormonas sintetizadas en los ápices de los brotes y en la raíz, respectivamente, promueven la señalización a larga distancia para suprimir la ramificación en varias especies. La síntesis y la respuesta a las estrigolactonas a través de la vía conservada MAX/RMS, descrita en Arabidopsis y guisante, se ha encontrado también en monocotiledóneas petunia (Petunia hybrida) , y arroz. Los genes que actúan dentro de las yemas retrasando su desarrollo y crecimiento también están conservados. El gen Teosinte branched1 (Tb1) aislado en maíz y en otras monocotiledóneas codifica para un factor de transcripción de la familia TCP. Los genes TCP, exclusivos de plantas, codifican para factores de transcripción que contienen el llamado dominio TCP, secuencia de 59 aminoácidos con una región básica y un dominio hélice-lazo-hélice, que confiere capacidad de unión DNAyaotras proteínas (Cubas et al., 1999. Plant Journal. 18:215-222) , que se expresa en los MA y en las yemas axilares, donde suprime su crecimiento. Tb1 también controla la floración y el desarrollo de la inflorescencia. En dicotiledóneas, la duplicación de Tb1 ha dado lugar a tres tipos de genes (CYC1, CYC2 y CYC3) uno de los cuales, el tipo CYC1, parece haber retenido la mayor parte de la actividad supresora de la ramificación, al menos en Arabidopsis, donde este gen recibe el nombre de BRANCHED1 (BRC1) . BRC1 actúa dentro de las yemas impidiendo su desarrollo. BRC1 está controlado a nivel transcripcional por la ruta MAX y responde a estímulos ambientales y de desarrollo suprimiendo la ramificación.

A pesar de que los genes que tienen un papel clave en el control del desarrollo axilar están muy conservados, la diversidad de los modelos de ramificación encontrados en angiospermas sugiere que la modulación de este proceso ha divergido en los diferentes grupos filogenéticos (clados) , lo que es soportado por la diferente regulación de los genes de tipo MAX en guisante, Arabidopsis y arroz. Es muy posible que la evolución función y regulación de los genes tipo BRC1 también haya jugado un importante papel en esta evolución. Al contrario que las alteraciones en las vías de señalización, que a menudo generan efectos pleiotrópicos no deseados, las modificaciones en la regulación de factores de transcripción que se expresan localmente, como BRC1, que actúa exclusivamente en las yemas axilares, podría ser más fácilmente toleradas. Los reguladores transcripcionales han jugado un papel clave en la evolución de muchos rasgos morfológicos. De hecho, durante la domesticación del maíz, la mejora genética para obtener plantas con una fuerte dominancia apical, dio lugar a la selección de plantas que sobreexpresaban Tb1. CYCLOIDEA, otro factor de transcripción de la familia TCP, ha sido responsable de la evolución de la simetría bilateral floral, una innovación morfológica que ha evolucionado independientemente en distintos clados.

El control del desarrollo de las yemas axilares tiene un gran potencial aplicado ya que conocer sus bases genéticas nos puede permitir controlar la arquitectura de plantas de interés agronómico.

Por inhibición del desarrollo axilar podemos promover el crecimiento en un único eje favoreciendo tallos largos y con pocos nudos como es deseable, por ejemplo, en especies de leñosas que se explotan para producción de madera, otras que se cultivan a alta densidad como ciertas gramíneas o aquellas en las que los tallos laterales son una traba para la recolección mecanizada. Podemos favorecer el aporte de nutrientes a los ejes que están desarrollando frutos (Ej. tomate) o prolongar la vida media de almacenamiento de ciertos productos cuyos brotes reducen su calidad (Ej.

patatas, cebollas, ajos) . La mejora clásica ha permitido obtener variedades con un único tallo o “monostem” en algunas especies (Ej. girasol) , sin embargo en otras (Ej. tabaco, tomate) no se ha conseguido disponer de este carácter en líneas de alta producción. Las técnicas alternativas empleadas para obtener plantas con un único tallo (eliminación manual de las ramas laterales, aplicación de productos químicos) no sólo encarecen la producción sino que favorecen la propagación de enfermedades y pueden conllevar problemas de contaminación ambiental.

Favoreciendo el desarrollo axilar, podemos generar arquitecturas arbustivas y aumentar la producción de hojas y flores, elementos apreciados en especies ornamentales o en aquellas en las que las hojas o los frutos son los productos de consumo. El incremento de la formación de retoños tiene también interés en especies que se utilizan para el tapizado de terrenos, en las que se valora el crecimiento compacto (Ej. gramíneas de césped o pasto) . Sería de gran valor ecológico fomentar el crecimiento intercalar en especies rastreras adaptadas a terrenos áridos amenazados por la erosión en los que la hierba resulta costosa de mantener. La producción de nuevos brotes también tiene importancia en propagación vegetativa y cultivo in vitro.

Por último, en ciertas especies de leñosas el control de la brotación de las yemas axilares cuya regulación fisiológica y hormonal es comparable a la de herbáceas tiene gran importancia económica. En vides, cerezos, manzanos, y otras leñosas, las yemas axilares requieren una exposición al frío de días o semanas para brotar. Estas especies se han empezado a cultivar en países cálidos (Ej. Brasil y Tailandia) en los que no se suelen alcanzar temperaturas bajas, por lo que los agricultores se ven obligados a emplear, para hacer brotar las yemas, tratamientos químicos muy tóxicos (ácido cianhídrico, dinitro-orthocresol) , o costosos tratamientos hormonales de rápida degradación y que producen efectos no deseados.

Las Solanáceas, y entre ellas la tomatera (Solanum lycopersicum) y la patata (Solanum tuberosum) , son plantas de gran importancia económica, en las que algunas de sus características de interés agronómico dependen de la... [Seguir leyendo]

1. Polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 95% con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3.

2. Polinucleótido de ARN o ADN aislado capaz de traducirse a una secuencia aminoacídica que comprende un péptido que presenta una identidad de al menos un 99% con la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3.

3. Polinucleótido de ARN o ADN aislado según la reivindicación anterior, capaz de traducirse a la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3.

4. Construcción genética de ADN o ARN, que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias:

a. secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su transcripción in vitro o in vivo, o

b. secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, operativamente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y con otras secuencias necesarias

o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar.

5. Construcción genética según la reivindicación 4, donde el promotor es un polinucleótido de ARN o ADN aislado, capaz de dirigir la expresión de un gen de interés en los meristemos axilares de una planta que presenta una identidad con la SEQ ID NO: 5 seleccionada de entre cualquiera de las siguientes:

a. al menos un 95%, o

b. al menos un 99%.

6. Construcción genética según la reivindicación 4, donde el promotor es un polinucleótido de ARN o ADN aislado, capaz de dirigir la expresión de un gen de interés en los meristemos axilares de una planta que presenta una identidad con la SEQ ID NO: 6 seleccionada de entre cualquiera de las siguientes:

a. al menos un 95%, o

b. al menos un 99%.

7. Construcción genética según la reivindicación 4, donde el promotor es un polinucleótido de ARN o ADN aislado, capaz de dirigir la expresión de un gen de interés en los meristemos axilares de una planta, que se selecciona de la lista que comprende:

a. SEQIDNO:5, ó

b. SEQ ID NO: 6.

8. Uso de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o de una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, para modificar la arquitectura de una planta.

9. Método para modificar la arquitectura vegetal de una planta que comprende:

a. transfectar un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en una célula o cultivo de células vegetales hospedantes,

b. crecer la célula o el cultivo de células vegetales hospedantes en un medio adecuado, hasta regenerar una planta completa.

10. Método para expresar un gen de interés en los meristemos axilares de una planta que comprende:

a. transfectar un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en una célula o cultivo de células vegetales hospedantes,

b. crecer la célula o el cultivo de células vegetales hospedantes en un medio adecuado, hasta regenerar una planta completa.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, donde la célula transfectada puede clasificarse taxonómicamente como perteneciente a la especie Solanum tuberosum.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, donde la célula transfectada puede clasificarse taxonómicamente como perteneciente a la especie Solanum lycopersicum.

13. Agente modulador de la expresión de los genes StBRC1L1 o de los polinucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que se selecciona de la lista que comprende:

a. un oligonucleótido antisentido,

b. un RNA interferente, ó

c. un anticuerpo, (o fragmento del mismo) .

14. Agente modulador según la reivindicación 13, que consiste en un polinucleótido de ADN o ARN aislado que comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 13.

15. Construcción genética que comprende un polinucleótido aislado según la reivindicación 14.

16. Composición que comprende un agente modulador según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, o una construcción genética según la reivindicación 15.

17. Uso de un agente modulador según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, una construcción genética según la reivindicación 15, o de una composición según la reivindicación 16, para modificar la arquitectura de una planta.

18. Semilla cuyo material genético integra el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 ó 14, o la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 4-7 ó 15.

19. Célula vegetal cuyo material genético integra el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 ó 14, o la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 4-7 ó 15.

20. Cultivo de células vegetales según la reivindicación 19.

21. Planta que comprende células según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 y/o obtenida tras el crecimiento de la semilla según la reivindicación 18.

22. Grano de polen cuyo material genético es un derivado del material genético de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 19-20.

23. Semilla según la reivindicación 18, célula vegetal según la reivindicación 19, cultivo de células vegetales según la reivindicación 20, planta según la reivindicación 21, o grano de polen según la reivindicación 22, que puede clasificarse taxonómicamente como perteneciente a la familia Solanaceae.

24. Semilla según la reivindicación 18, célula vegetal según la reivindicación 19, cultivo de células vegetales según la reivindicación 20, planta según la reivindicación 21, o grano de polen según la reivindicación 22, que puede clasificarse taxonómicamente como perteneciente a la especie Solanum tuberosum.

25. Semilla según la reivindicación 18, célula vegetal según la reivindicación 19, cultivo de células vegetales según la reivindicación 20, planta según la reivindicación 21, o grano de polen según la reivindicación 22, que puede clasificarse taxonómicamente como perteneciente a la especie Solanum lycopersicum.

26. Grupo de células según la reivindicación 19, que forman los tubérculos ó minitubérculos.

27. Planta, fruto, semilla, célula, grupo de células o partes de la planta de patata, que presentan una arquitectura vegetal modificada con respecto a una planta tipo control, donde la modificación de la arquitectura vegetal se debe a mutaciones no transgénicas en los genes StBRC1L1 de patata.

28. Método para obtener plantas de patata con arquitectura vegetal modificada, en comparación con una planta silvestre control, que comprende:

a. obtener material vegetal de una planta (parental) de patata,

b. someter a un proceso de mutagénesis el material vegetal del paso (a) ,

c. cultivar el material vegetal mutado hasta regenerar una planta completa, y su descendencia,

d. analizar la descendencia de las plantas del paso (c) para detectar al menos una mutación en al menos una copia los genes StBRC1L1 y StBRC1L2,

e. seleccionar los descendientes con al menos una mutación en al menos una copia de los genes StBRC1L1 y StBRC1L2 que presenten su arquitectura vegetal modificada en comparación con una planta tipo control,

f. opcionalmente, cultivar la planta seleccionada para obtener descendencia que presente dicha modificación de la arquitectura vegetal.

29. Método según de la reivindicación 28, donde el proceso de mutagénesis del paso (b) se realiza con mutágenos químicos.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Consejo Superior de investigaciones Científicas (CSIC)

<120> Gen regulador de la ramificación de plantas, promotores, construcciones genéticas que lo contienen y usos

<130> ES1641.344 Bis

<160> 52

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 346

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

<400> 1

ES 2 371 316 A1

<210> 2

<211> 337

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

<400> 2

ES 2 371 316 A1

<210> 3

<211> 353

ES 2 371 316 A1

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<400> 3

<210> 4

<211> 364

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> misc_feature

<222> (28) .. (28)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 4

ES 2 371 316 A1

<210> 5

<211> 1723

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 5

<210> 6

<211> 665

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 6

<210> 7

<211> 1133

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 7 <210> 8

<211> 1124

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 8

<210> 9

<211> 1059

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<400> 9 <210> 10

<211> 1092

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<400> 10 <210> 11

<211> 225

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> RNAi para el gen SlBRC1L1

<400> 11

<210> 12

<211> 415

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> RNAi para el gen SlBRC1L2

<400> 12

<210> 13

<211> 185

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> RNAi para el gen StBRC1L1

<400> 13 <210> 14

<211> 168

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> RNAi para el gen StBRC1L2

<400> 14

<210> 15

<211> 1041

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 15

<210> 16

<211> 1014

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 16

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador Le1

<400> 17

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador Le2

<400> 18 <210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador LeTCP2-F1

<400> 19

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador LeTCP2-F1 nested

<400> 20

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador LeTCP2-R1

<400> 21

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador LeTCP2-R1 nested

<400> 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador LeTCP2 cDNA-F

<400> 23

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador LeTCP2 cDNA-R

<400> 24

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador Le3

<400> 25

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador GSP1-TCP1

<400> 26

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador GSP2-TCP1

<400> 27

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador GSP1-TCP2

<400> 28

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador GSP2-TCP2

<400> 29

<210> 30

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para el extremo 5’ de SlBRC1L1

<400> 30

<210> 31

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para el extremo 3’ de SlBRC1L1

<400> 31

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para el extremo 5’ de SlBRC1L2

<400> 32

<210> 33

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador para el extremo 3’ de SlBRC1L2

<400> 33

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador racest1-5’

<400> 34

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador StTCP1-ORF1

<400> 35

<210> 36

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador B26

<400> 36

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<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador B25

<400> 37

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador genómico-StTCP1A

<400> 38

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador genómico-StTCP1B

<400> 39

<210> 40

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador StTCP2-A

<400> 40

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador StTCP2-B

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador St2-Seq 1

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador St2-Seq 2

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<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador StTCP2-5’

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<212> DNA

<213> Artificial

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> cebador del extremo 5’ de StBRC1L1

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<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador del extremo 3’ de StBRC1L1

<400> 47

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> cebador del extremo 5’ del gen StBRC1L2

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<212> DNA

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<223> cebador del extremo 3’ del gen StBRC1L2

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<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

ES 2 371 316 A1

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<210> 51

<211> 362

<212> PRT

<213> Solanum tuberosum

<220>

<221> misc_feature

<222> (28) .. (28)

<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid

<400> 51

ES 2 371 316 A1

<210> 52

<211> 1086

<212> DNA

<213> Solanum tuberosum

<400> 52