Una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada según SEC ID Nº:

1, en la que los aminoácidos en lasposiciones P427 y W535 están sustituidos con otro aminoácido, y en la que la actividad hemolítica de la proteínaSLO mutante se reduce al menos el 50 % con respecto a SLO natural.

Formas mutantes de estreptolisina O

Campo de la invención

La invención se refiere a los campos de la inmunología y la vacunología.

Antecedentes de la invención

La estreptolisina O (SLO; GAS25) es uno de los factores de virulencia más importantes del patógeno humano Streptococcus pyogenes (GAS) . Debido a su capacidad para provocar una respuesta inmunitaria temprana e intensa en seres humanos, se usa rutinariamente como marcador de diagnóstico de infección por GAS.

La SLO pertenece a la familia de las citolisinas activadas con tiol altamente homólogas (TACY) , que ejercen su

actividad citolítica por la interacción con colesterol sobre la membrana celular, auto-oligomerización y formación de poros. Además, su capacidad para activar directamente la vía del complemento clásica por unión a la región Fc de IgG humana puede producir el ataque directo mediado por complemento sobre células huésped. Las TACY también pueden interferir con la defensa del huésped y la función de células inmunitarias por medio de la inducción de citocinas y mediadores inflamatorios.

Algunas TACY pueden proteger pasiva y activamente a los animales de laboratorio. Véase FEMS Lett. 182, 197205, 2000. Sin embargo, el uso de estas toxinas como candidatos a vacuna ha sido dificultado por su complejo patrón de efectos secundarios perjudiciales. Por tanto, hay una necesidad en la materia de proteínas SLO que no sean tóxicas.

El documento WO 2005/108419 describe composiciones de vacuna que comprenden proteínas de citolisina de unión 20 a colesterol mutantes que incluyen proteínas SLO mutantes.

El documento WO 93/05155 describe la expresión y purificación de una proteína SLO mutante y el análisis de su actividad hemolítica.

Pinkey y col. (Infection and Immunity 57:8, 1989) describen el análisis de las actividades hemolíticas de SLO natural y varias proteínas SLO mutantes.

El documento GB 2233977 describe proteínas SLO mutantes y describe el análisis de su actividad citolítica.

Breve descripción de las figuras

FIG. 1. Modelo informático tridimensional de SLO. Las prolinas se representan como espacio relleno. Pro427 está coloreada en blanco. FIG. 2. Gráfica que muestra los resultados del ensayo hemolítico usando extractos de E. coli que contienen

SLO natural y el mutante de SLO P427L. FIG. 3. Fotomicrografía de gel de SDS-poliacrilamida que muestra el mutante de SLO purificado P427L. FIG. 4. Gráfica que muestra los resultados del ensayo hemolítico usando SLO natural purificada y el mutante

de SLO P427L. FIG. 5. Fotomicrografía de gel de SDS-poliacrilamida de sobrenadantes de lisado de E. coli. Carril A, control

negativo de E. coli; carril B, rSLO natural, sin marca; carril C, rSLO P427L, sin marca; y carril D, rSLO natural purificada, sin marca (5 mg) . FIG. 6. Gráfica que demuestra que bajo las mismas condiciones el mutante de SLO P427L es 1000 veces

menos hemolítico que SLO natural. FIG. 7. Gráfica que demuestra los efectos del colesterol sobre la hemólisis por SLO natural y el mutante de 40 SLO P427L. FIG. 8. Fotomicrografías del análisis de SDS-PAGE de proteínas sin marca totales en extractos de células.

FIG. 8A, expresión de proteínas sin marca SLO natural y P427L; FIG. 8B, expresión de proteínas sin marca SLO P427L + W535, P427L + C530G, y P427L + C530G + W535F. FIG. 9. Fotomicrografía del análisis de SDS-PAGE de proteínas marcadas con His totales en extractos de

45 células. FIG. 10. Fotomicrografía del análisis de SDS-PAGE de proteínas marcadas con His purificadas. FIG. 11. Fotomicrografías del análisis de SDS-PAGE de proteínas sin marca purificadas. FIG. 11A, Carriles:

A, SLO natural sin marca; B, SLO P427L sin marca; marcadores de peso molecular (116-66, 2-45-35-25-18, 414, 4) ; la flecha negra indica proteína SLO purificada de mutantes y clones naturales. FIG. 11B, carril A, SLO natural sin marca (3 µg) , carril B, SLO P427L-W535F sin marca (3 µg) ; marcadores de peso molecular (11666, 2-45-35-25-18, 4-14, 4) ; la flecha negra indica proteína SLO purificada de mutantes y clones naturales.

FIG. 12. Fotomicrografía de análisis de SDS-PAGE de proteína SLO natural sin marca purificada. Muestras de diferentes lotes de purificación de SLO natural se analizaron bajo condiciones reductoras y no reductoras.

FIG. 13. Gráfica que muestra los resultados de las pruebas de hemólisis de mutantes de SLO marcados con His.

FIG. 14. Gráfica que muestra la inhibición de la actividad hemolítica inducida por SLO por antisuero anti-SLO.

FIG. 15. Gráfica que muestra la valoración de la inhibición por antisuero anti-SLO de la hemólisis de SLO.

FIG. 16. Gráfica que muestra la valoración de la actividad hemolítica de SLO.

FIG. 17. Gráfica que muestra la valoración de la actividad hemolítica de SLO natural, SLO natural químicamente desintoxicada y mutantes de SLO (P427L; P427L + W535F) .

FIG. 18. Gráfica que muestra la valoración de la actividad hemolítica de SLO natural y mutantes de SLO (P427L; P427L + W535F) .

FIG. 19. Gráfica que muestra la valoración de la actividad hemolítica de SLO natural y SLO natural químicamente desintoxicada.

FIG. 20. Gráfica que muestra la dilución de antisuero contra el mutante de SLO P427L + W535F requerida para obtener el 50 % de reducción de la actividad hemolítica de SLO (50 ng/ml de SLO) .

FIG. 21. Gráfica que muestra la dilución de antisuero contra el mutante de SLO P427L + W535F requerida para obtener el 50 % de reducción de actividad hemolítica de SLO (100 ng/ml de SLO) .

FIG. 22. Curva de valoración que muestra que los ensayos de inhibición de la hemólisis se realizaron con concentraciones de toxina que permitieron el 100 % de hemólisis.

FIG. 23. Alineamiento de proteínas SLO. M1_SF370, SEC ID Nº: 1; M12_2096, SEC ID Nº: 2; M12_9429, SEC ID Nº: 3; M1_5005, SEC ID Nº: 4; M2, SEC ID Nº: 5; M28, SEC ID Nº: 6; M6, SEC ID Nº: 7; M18, SEC ID Nº: 8; M5, SEC ID Nº: 9; M3, SEC ID Nº: 10; M3_SSI, SEC ID Nº: 11; y M4, SEC ID Nº: 12.

FIG. 24. Alineamiento de SLO natural y mutantes de SLO marcados con His. SLO_M1 strainSF370, SEC ID

FIG. 25. Gráfica que compara la reducción de la actividad hemolítica de SLO por antisuero contra SLO natural y antisuero contra el mutante de SLO P427L + W535F.

FIG. 26. Gráfica que muestra las propiedades protectoras in vivo del mutante de SLO recombinante P427L + W535F usando tanto alumbre como MF59 como adyuvante.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona mutantes de estreptolisina O (SLO; GAS25) que no son tóxicos, pero que todavía mantienen la capacidad para inducir protección contra S. pyogenes. Formas mutantes de SLO son útiles, entre otras cosas, en composiciones de vacuna, para inducir protección contra S. pyogenes.

La invención proporciona una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada según SEC ID Nº: 1 en la que los aminoácidos en las posiciones P427 y W535 están sustituidos por otro aminoácido, y en la que la actividad hemolítica de la proteína SLO mutante se reduce al menos el 50 % con respecto a SLO natural.

La invención también proporciona una proteína SLO mutante purificada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 25 y SEC ID Nº: 27.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína SLO mutante como se ha descrito anteriormente.

La invención también proporciona una composición de vacuna que comprende:

(a) un agente activo seleccionado de:

(i) proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se ha... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada según SEC ID Nº: 1, en la que los aminoácidos en las posiciones P427 y W535 están sustituidos con otro aminoácido, y en la que la actividad hemolítica de la proteína SLO mutante se reduce al menos el 50 % con respecto a SLO natural.

2. Una proteína SLO mutante purificada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID Nº: 25 y SEC ID Nº: 27.

3. La proteína SLO mutante purificada de la reivindicación 1 que se acopla a una proteína portadora.

4. La proteína SLO mutante purificada de la reivindicación 3, en la que la proteína portadora está seleccionada del grupo que consiste en una toxina bacteriana, un toxoide bacteriano, una proteína de la membrana externa de N. meningitidis, una proteína de choque térmico, una proteína de pertussis, proteína D de H. influenzae, una citocina, una linfocina, una hormona, un factor de crecimiento, toxina A de C. difficile, toxina B de C. difficile y una proteína de captación de hierro.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína SLO mutante de la reivindicación 1 o de la reivindicación

2.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo de secuencias codificantes mostradas en SEC ID Nº: 31 y SEC ID Nº: 33.

7. Una composición de vacuna que comprende:

(a) un agente activo seleccionado de:

(i) proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2; y

(ii) una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2; y

(b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. La composición de vacuna de la reivindicación 7 que comprende además uno o más agentes activos seleccionados del grupo que consiste en:

(iii) un antígeno de GAS;

(iv) una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno de GAS;

(v) un agente activo que es útil en una vacuna pediátrica tal como un antígeno polipeptídico de un patógeno seleccionado del grupo que consiste en N. meningitidis, S. pneumoniae, Bordetella pertussis, Moraxella catarrhalis, Clostridium tetani, Cor y nebacterium diphtheriae, virus respiratorio sincitial, virus de la poliomielitis, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubeola y antígenos polipeptídicos de rotavirus, o una molécula de ácido nucleico que codifica el antígeno polipeptídico; y

(vi) un agente activo que es útil en una vacuna para ancianos o individuos inmunodeprimidos tal como un antígeno polipeptídico de un patógeno seleccionado del grupo que consiste en Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, antígenos polipeptídicos del virus de la gripe y del virus paragripal, o una molécula de ácido nucleico que codifica el antígeno polipeptídico.

9. Un procedimiento de preparación de una vacuna para la prevención o el tratamiento de infección por Streptococcus pyogenes que comprende combinar:

(a) un agente activo seleccionado de:

(i) una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se define en la reivindicación 1

o en la reivindicación 2; y

(ii) una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2; y

(b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el agente activo es la proteína SLO mutante purificada y la proteína SLO mutante se prepara mediante un procedimiento que comprende:

(a) cultivar una célula huésped que comprende una construcción de expresión que codifica la proteína SLO mutante; y

(b) recuperar la proteína SLO mutante.

11. El procedimiento de la reivindicación 9 que comprende además combinar con el vehículo farmacéuticamente aceptable uno o más agentes activos seleccionados del grupo que consiste en:

(iii) un antígeno de GAS; y

(iv) una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno de GAS.

5 12. Uso de un agente activo en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir infección por Streptococcus pyogenes, en el que el agente activo está seleccionado del grupo que consiste en:

(i) una proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2; y

(ii) una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de estreptolisina O (SLO) mutante purificada 10 como se define en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2.

13. Una proteína SLO mutante purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6 para su uso como una vacuna.

14. Una proteína SLO mutante purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, una molécula de ácido

nucleico de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6, o una composición de vacuna de la reivindicación 7 o de la 15 reivindicación 8 para su uso en terapia.

15. Una proteína SLO mutante purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5 o de la reivindicación 6, o una composición de vacuna de la reivindicación 7 o de la reivindicación 8 para tratar o prevenir infección por Streptococcus pyogenes.