Un ácido nucleico que comprende: una primera secuencia de nucleótido que codifica proteínas no estructurales y una proteína de cápsida (C) de una vacuna del virus del dengue 2 atenuado de la cepa PDK-53;

y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína premembrana (prM) y una proteína de la envoltura (E) del virus del dengue 3, en la que la proteína E contiene una leucina en la posición del aminoácido 345, correspondiendo dicha leucina a la leucina en la posición del aminoácido 625 de la SEQ ID NO: 10

Flavivirus quiméricos avirulentos e inmunógenos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a los campos de la inmunología y la virología y más concretamente a flavivirus quiméricos avirulentos e inmunógenos para la producción de vacunas de flavivirus atenuados, vivos e inmunógenos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los virus del dengue son patógenos transmitidos por mosquitos del género Flavivirus (familia Flaviviridae) . Se han identificado cuatro serotipos del virus del dengue (abreviados a menudo como “DEN”) , que incluyen dengue-1, dengue-2, dengue-3, dengue-4 (DEN-1 a DEN-4) . El genoma del flavivirus es un ARN monocatenario de sentido positivo de aproximadamente 11 kb de longitud, que contiene una región 5' no codificante (5'NC) ; una región codificante que codifica las proteínas estructurales víricas; cinco proteínas no estructurales, designadas como NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5; y una región 3' no codificante (3'NC) . Las proteínas estructurales víricas incluyen la cápsida, la premembrana/membrana y la envuelta. Las proteínas estructurales y no estructurales se traducen como una única poliproteína. La proteína se procesa a continuación mediante proteasas celulares y víricas.

Transmitidos por los mosquitos Aedes aegypti a los seres humanos en las regiones tropicales y subtropicales del mundo, los virus del dengue producen millones de casos de enfermedad cada año, variando desde la fiebre del dengue a la a menudo fatal fiebre hemorrágica del dengue/síndrome de choque del dengue (DHF/DSS) . La infección secundaria de los seres humanos con un serotipo heterólogo del virus DEN puede inducir una respuesta inmunopatológica y se considera un posible factor de riesgo para la DHF/DSS. Por tanto, existe la necesidad del desarrollo de una vacuna que confiera protección frente a todas las cepas del virus del dengue.

Debido a que la erradicación de los mosquitos Aedes aegypti parece ser prácticamente imposible, el desarrollo de vacunas eficaces seguras frente a los cuatro serotipos del virus del dengue es una prioridad de la Organización Mundial de la Salud. Sin embargo, está actualmente disponible una vacuna eficaz, no aprobada, contra cualquiera de los cuatro serotipos del virus del dengue. Se ha demostrado que el paso en serie de flavivirus naturales por diversos cultivos celulares, tales como en células primarias de riñón de perro (PDK) , produce variantes del virus que han perdido virulencia, retienen la inmunogenicidad y producen síntomas clínicos no adversos.

En la Mahidol University de Tailandia han desarrollado virus del dengue vivos atenuados de los cuatro serotipos haciendo pasar virus naturales por el cultivo celular. Representan en la actualidad los candidatos más prometedores a vacunas de virus atenuados vivos para inmunizar contra la infección y/o la enfermedad del virus del dengue. Estas vacunas candidatas se han designado mediante una combinación de su serotipo del dengue, la línea celular a través de la cual se pasaron y el número de veces que se pasaron. De esta manera, un virus natural del dengue del serotipo 1 pasado en células PDK 13 veces se designa cono virus DEN-1 PDK-13. Las otras vacunas candidatas son DEN-2 PDK-53 (secuencia de nucleótidos, de la SEQ ID NO: 15; secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO: 16) , DEN-3 PGMK-30/FRhL-3 (treinta pases en las células primarias de riñón de mono verde, seguido por tres pases en células fetales de pulmón de macaco) y DEN-4 PDK-48. Estos cuatro virus candidatos de vacunas se derivaron mediante pases en el cultivo de tejidos de los virus DEN-1 16007, DEN-2 16681. DEN-3 16562 y DEN-4 1036 parentales naturales, respectivamente.

Los ensayos clínicos preliminares en seres humanos con estos virus atenuados han indicado que DEN2 PDK-53 tiene la dosis infecciosa más baja (dosis infecciosa mínima del 50% de 5 unidades de formación de placas o UFP) , en seres humanos, es fuertemente inmunógeno y no produce síntomas clínicos inaceptables. Las vacunas de los virus DEN-1 PDK-13, DEN-3 PGMK-30/FRhL-3 y DEN-4 PDK-48 tienen dosis infecciosas mínimas superiores al 50%, de 10.000, 3500, y 150 UFP, respectivamente, en seres humanos Las mayores dosis infecciosas requeridas para las últimas tres vacunas candidatas aumentan las preocupaciones con respecto a la eficacia relativa de cada componente del serotipo en una vacuna tetravalente de virus del dengue. Aunque solamente se necesitó una única inmunización con el virus DEN-2 PDK-53 o el virus DEN-4 PDK-48 monovalente para conseguir un 100% de seroconversión en sujetos humanos, se necesitó un estímulo de refuerzo para conseguir el mismo índice de seroconversión para los virus DEN-1 PDK-13 y DEN-3 PGMK-30/FRhL-3, que tienen dosis infecciosas más elevadas para los seres humanos.

El virus DEN-2 PDK-33 de la vacuna candidata, abreviado de ahora en adelante como PDK-53, tiene algunos marcadores biológicos asociados con la atenuación que se pueden medir, entre los que se incluyen la sensibilidad a la temperatura, tamaño pequeño de la placa, replicación decreciente en el cultivo de células C6/36 de mosquito, replicación decreciente en mosquitos intactos, pérdida de neurovirulencia en ratones lactantes e incidencia decreciente de viremia en monos. Los ensayos clínicos de la vacuna PDK-53 candidata han demostrado su seguridad e inmunogenicidad en seres humanos. Además, la vacuna PDK-53 induce respuestas de memoria en los linfocitos T específicos del virus del dengue en los receptores humanos de las vacunas. Se han identificado diferencias de nucleótidos entre DEN-2 16681 y PDK-53 (Kinney y col., Virology, 230, 1997) .

Excepto para el virus DBN-2 PDK-53, el número y la identidad de las mutaciones genéticas que se acumulan durante los múltiples pases en el cultivo celular y que se asocian con los fenotipos atenuados de las vacunas candidatas son desconocidos. Ni las contribuciones relativas de dichas nutaciones asociadas a la atenuación al mecanismo real de la atenuación, ni el potencial de las mutaciones inversas de invertir cualquiera de las vacunas candidatas al fenotipo biológico virulento del virus del dengue natural se conocen para cualquiera de estas cuatro vacunas candidatas. Resulta crítica una comprensión de los marcadores de la atenuación de una vacuna candidata para la predicción de su estabilidad y seguridad.

De acuerdo con esto, existe una necesidad de virus del dengue avirulentos, aún inmunógenos a utilizar en el desarrollo de vacunas del virus del dengue, para conferir protección contra uno o más serotipos del virus del dengue. Lo que sería ideal es una vacuna que protegiera de manera simultánea a un individuo contra varias cepas virulentas de esta familia potencialmente peligrosa (Flaviviridae) de virus. Por tanto, se necesita particularmente una vacuna tetravalente que se pueda usar para inmunizar a un individuo frente a los cuatro serotipos del dengue.

[010] Se han descrito virus quiméricos para uso en vacunas. El documento WO93/06214 describe un virus quimérico para uso en una preparación de vacuna que tiene un genoma que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína estructural de un flavivirus y secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína no estructural de otro flavivirus.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[011] Se describen flavivirus quiméricos inmunógenos, una estructura del virus del dengue 2 para preparar los flavivirus quiméricos y los procedimientos para producir los flavivirus quiméricos. Se proporcionan flavivirus quiméricos inmunógenos, solos o en combinación, en un vehículo farmacéuticamente aceptable en forma de composiciones inmunógenas para minimizar, inhibir, o inmunizar a individuos frente a la infección mediante uno o más flavivirus o cepas flavivíricas, particularmente, cepas del virus del dengue de los serotipos DEN-1, DEN-2, DEN3 y DEN-4. Cuando se combinan, se pueden usar flavivirus quiméricos inmunógenos como vacunas multivalentes para conferir protección simultánea frente a la infección por más de una especie o cepa de flavivirus. Preferiblemente, los flavivirus quiméricos se combinan en una composición inmunógena útil como vacuna tetravalente contra los cuatro serotipos conocidos de virus del dengue.

[012] Los flavivirus quiméricos inmunógenos avirulentos proporcionados en la presente memoria descriptiva contienen genes de las proteínas no estructurales del virus del dengue 2 atenuado, o de uno de sus equivalentes, y uno o más de los genes de las proteínas estructurales o de sus porciones inmunógenas del flavivirus contra el cual se va a... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico que comprende:

una primera secuencia de nucleótido que codifica proteínas no estructurales y una proteína de cápsida (C) de una vacuna del virus del dengue 2 atenuado de la cepa PDK-53; y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína premembrana (prM) y una proteína de la envoltura (E) del virus del dengue 3, en la que la proteína E contiene una leucina en la posición del aminoácido 345, correspondiendo dicha leucina a la leucina en la posición del aminoácido 625 de la SEQ ID NO: 10.

2. Un ácido nucleico que comprende: una primera secuencia de nucleótido que codifica proteínas no estructurales y una proteína de cápsida (C) de una vacuna del virus del dengue 2 atenuado de la cepa PDK-53, en la que la proteína C contiene una serina en la posición del aminoácido 100, correspondiendo dicha serina a la serina en la posición del aminoácido 100 de la SEQ ID NO: 12; y una segunda secuencia de nucleótido que codifica una proteína premembrana (prM) y una proteína de la envoltura (E) del virus del dengue 4, en la que la proteína E contiene una leucina en la posición del aminoácido 447, correspondiendo dicha leucina a la leucina en la posición del aminoácido 727 de la SEQ ID NO: 12.

3. El ácido nucleico de la reivindicación 2, que comprende además una valina en la posición 364 de la proteína E.

4. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína prM y la proteína E proceden de una cepa virulenta.

5. El ácido nucleico de la reivindicación 1, que codifica la SEQ ID NO: 10.

6. El ácido nucleico de la reivindicación 5, que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9.

7. El ácido nucleico de la reivindicación 2, que codifica la SEQ ID NO: 12.

8. El ácido nucleico de la reivindicación 7, que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11.