Un polinucleótido de Neublastina aislado que codifica un polipéptido que posee actividad neurotrófica,

en el que el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en: a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ NO: 1, b) un polinucleótido que codifica un polipéptido de Neublastina o un polipéptido derivado de éste, en el que la parte madura de dicho polipéptido presenta un grado de identidad de al menos 90% con los aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID NO: 2; c) un polinucleótido que hibrida específicamente bajo condiciones de hibridación de una disolución de astringencia alta con el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 1; d) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 70% idéntica a la secuencia del polinucleótido presentada como SEQ ID NO: 1

Factores neurotróficos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a polipéptidos de factor neurotrófico, a ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de factor neurotrófico y a anticuerpos que se unen específicamente a factores neurotróficos.

ANTECEDENTES

Los factores neurotróficos son proteínas naturales que estimulan la supervivencia, mantienen la diferenciación fenotípica, evitan la degeneración e incrementan la actividad de las células y tejidos neuronales. Los factores neurotróficos se aíslan de tejido neural y de tejido no neural que está inervado por el sistema nervioso y se han clasificado en grupos relacionados funcionalmente y estructuralmente, también referidos como familias, superfamilias o subfamilias. Entre las superfamilias de los factores neurotróficos están las superfamilias del factor de crecimiento de fibroblastos, neurotrofina y factor de crecimiento transformante 1 (TGF-1) . Las especies individuales de factores neurotróficos se distinguen por su estructura física, su interacción con sus receptores compuestos y sus efectos sobre varios tipos de células nerviosas. Clasificados dentro de la superfamilia TGF-1 (Massague, et al, Trends in Cell Biology, 1994 4 172-178) están los ligandos del factor neurotrófico derivado de línea celular glial ("GDNF"; WO 93/06116) , que incluye GDNF, persefina (PSP"; Milbrandt et al., Neuron 1998 20 245-253) y neurturina ("NTN"; WO 97/08196) . Los ligandos de la subfamilia GDNF tienen en común su capacidad para inducir la señalización a través de la tirosina quinasa del receptor RET. Estos tres ligandos de la subfamilia GDNF se diferencian en sus afinidades relativas para una familia de receptores neurotróficos, los receptores GFRa.

Debido a los efectos de los factores neurotróficos en el tejido neuronal, todavía existe una necesidad de identificar y caracterizar factores neurotróficos adicionales para diagnosticar y tratar los trastornos del sistema nervioso.

Los miembros anteriores de la familia de ligandos GDNF y sus receptores y funciones correspondientes han sido revisados adicionalmente por Unsicker (Unsicker et al., Cell & Tissue Research, 1996 286 (2) 175-178) . También se hace referencia a las entradas de la base de datos relacionada con la presente invención, concretamente una secuencia de nucleótidos con fecha del 10 de marzo de 1998 de un EST de una biblioteca de ADNc de tejido tumoral de la glándula paratiroidea (Entrada de EMBL No. AA844072) y al clon BAC de Homo sapiens RP11-486I22 con fecha del 15 de junio de 1998 (No. de Registro EMBL AC005038, que lista 5 cóntigos de orden desconocido) .

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un factor neurotrófico nuevo denominado en la presente memoria "neublastina" o "NBN". La neublastina se clasifica dentro de la subfamilia GDNF porque comparte regiones de homología con otros ligandos GDNF (véanse las Tablas 3 y 4, más adelante) y por su capacidad para interaccionar con RET (véase, p. ej., Airaksinen et al., Mol. Cell. Neuroscience, 1999 13 313-325) , la neublastina es un factor neurotrófico nuevo y único. A diferencia de otros ligandos GDNF, la neublastina presenta una alta afinidad por el complejo GFRa3receptor RET y subregiones únicas en su secuencia de aminoácidos.

En particular, la invención se refiere a un polinucleótido aislado de Neublastina que codifica un polipéptido que posee actividad neurotrófica, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ NO: 1, b) un polinucleótido que codifica un polipéptido de Neublastina o un polipéptido derivado de éste, en el que la parte madura de dicho polipéptido presenta un grado de identidad de al menos 90% con los aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID NO: 2;

c) un polinucleótido que hibrida específicamente bajo condiciones de hibridación de una disolución de astringencia alta con el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 1

d) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 70% idéntica a la secuencia del polinucleótido presentada como SEQ ID NO: 1.

En otra realización, la invención se refiere a un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido. La invención también proporciona una célula huésped aislada que comprende dicho vector de expresión. La invención proporciona además una secuencia de ácido nucleico de cebador de PCR que consiste en una cualquiera de las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 23, 24, 25, 26 ó 28. También se proporciona por la invención un gen sintético que codifica un polipéptido de Neublastina, comprendiendo el gen sintético una secuencia mostrada en las SEQ ID NOs: 29 ó 30.

En otra realización, la invención se refiere a un polipéptido que posee actividad neurotrófica y que está codificado por un polinucleótido de la invención. La invención se refiere además a un polipéptido en el que la parte madura de dicho polipéptido presenta un grado de identidad de al menos 90% con los aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID NO: 2, en el que dicho polipéptido posee actividad neurotrófica. Además, la invención proporciona un método para preparar dicho polipéptido de la invención, así como un método para producir uno cualquiera de los polipéptidos mostrados en las SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 6 ó 7, que comprende cultivar una célula que contiene una cualquiera de las secuencias de nucleótidos mostradas en las SEQ ID NOs: 1 ó 3 bajo condiciones que permitan la producción del polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.

En otra realización, la invención se refiere a un método para producir un polipéptido de Neublastina de la invención, comprendiendo el método:

(a) introducir un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que codifica cuando se expresa un polipéptido de Neublastina en una célula o introducir una secuencia reguladora por recombinación homóloga en una célula, de manera que la secuencia reguladora regule la expresión de un gen de Neublastina endógeno, para preparar una célula que produce Neublastina;

(b) cultivar la célula que produce Neublastina bajo condiciones de cultivo que resulten en la expresión de un polipéptido de Neublastina.

En otra realización, la invención proporciona un péptido de Neublastina que consiste en cualquiera de las 15 secuencias siguientes:

En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de dichos péptidos de Neublastina.

En otra realización, la invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la invención se refiere a un polipéptido de la invención para usarse como un medicamento, en particular al uso de un polipéptido de la invención en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa. También se proporciona un polipéptido de la invención para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.

Un "polipéptido de neublastina", tal y como se usa en la presente memoria, es un polipéptido que posee actividad neurotrófica (p. ej., como se describe en los Ejemplos 6, 7, 8 y 9) e incluye aquellos polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con los polipéptidos de "neublastina" humanos mostrados en AA95-AA105 de SEQ ID NO: 2, AA1-AA105 de SEQ ID NO: 2, AA97-AA140 de SEQ ID NO: 4, AA41-AA140 de SEQ ID NO: 4 ("pro") , AA1-AA140 de SEQ ID NO: 4, AA80-AA140 de SEQ ID NO: 9 (prepro de "tipo salvaje") , AA41-AA140 de SEQ ID NO: 9 (pro) , AA1-AA140 de SEQ ID NO: 5 (140AA maduro) , AA1-AA116 de SEQ ID NO: 6 (116AA

maduro) , AA1-AA113 de SEQ ID NO: 7 (113AA maduro) , AA1-AA140 de SEQ ID NO: 10 (140AA maduro) , AA1-AA116 de SEQ ID NO: 11 (116AA maduro) , AA1-AA113 de SEQ ID NO: 12 (113AA maduro) y variantes y derivados de éstos. Además, esta invención contempla aquellos polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de homología con los polipéptidos de "neublastina" murinos mostrados en AA1-AA224 de SEQ ID NO: 16.

Preferiblemente, la secuencia C terminal de... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido de Neublastina aislado que codifica un polipéptido que posee actividad neurotrófica, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ NO: 1, b) un polinucleótido que codifica un polipéptido de Neublastina o un polipéptido derivado de éste, en el que la parte madura de dicho polipéptido presenta un grado de identidad de al menos 90% con los aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID NO: 2;

c) un polinucleótido que hibrida específicamente bajo condiciones de hibridación de una disolución de astringencia alta con el ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos complementaria a la SEQ ID NO: 1;

d) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 70% idéntica a la secuencia del polinucleótido presentada como SEQ ID NO: 1.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que la parte madura del polipéptido codificado presenta un grado de identidad de al menos 95% con los aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID NO: 2.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido codificado consiste en los aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID NO: 2.

4. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido codificado es SEQ ID NO: 2.

5. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido codificado es SEQ ID NO: 4.

6. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido codificado es SEQ ID NO: 5.

7. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido codificado es SEQ ID NO: 6.

8. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido codificado es SEQ ID NO: 7.

9. El polinucleótido de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3.

10. El polinucleótido de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de polinucleótido presentada como SEQ ID NO: 1.

11. El polinucleótido de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 90% idéntica a la secuencia de polinucleótido presentada como SEQ ID NO: 1.

12. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Una célula huésped aislada que comprende el vector de expresión de la reivindicación 12.

14. La célula de la reivindicación 13, en la que dicha célula es una célula eucariota.

15. La célula de la reivindicación 14, en la que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en una célula de mamífero, una célula fúngica y una célula de levadura.

16. La célula de la reivindicación 15, en la que dicha célula de mamífero se selecciona del grupo que consiste en una célula de ovario de hámster chino, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b y una célula madre neural humana.

17. Un polipéptido en el que la parte madura de dicho polipéptido presenta un grado de identidad de al menos 90% con los aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID NO: 2, en el que dicho polipéptido posee actividad neurotrófica.

18. El polipéptido de la reivindicación 17, en el que la parte madura de dicho polipéptido presenta un grado de identidad de al menos 95% con los aminoácidos 1 a 105 de SEQ ID NO: 2.

19. El polipéptido de la reivindicación 17, que es un polipéptido factor neurotrófico Neublastina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2.

20. El polipéptido de la reivindicación 17, que es un polipéptido factor neurotrófico Neublastina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4.

21. El polipéptido de la reivindicación 17, que es un polipéptido factor neurotrófico Neublastina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5.

22. El polipéptido de la reivindicación 17, que es un polipéptido factor neurotrófico Neublastina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 6.

23. El polipéptido de la reivindicación 17, que es un polipéptido factor neurotrófico Neublastina que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 7.

24. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 23, en el que dicho polipéptido está glicosilado.

25. Un polipéptido que posee actividad neurotrófica y que está codificado por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

26. Un método para preparar el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, comprendiendo dicho método la etapa de expresar dicho polipéptido a partir de un polinucleótido de factor neurotrófico Neublastina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

27. El método de la reivindicación 26, que comprende la etapa de cultivar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 que comprende dicho polinucleótido de factor neurotrófico Neublastina en un medio de cultivo que permite la producción de dicho polipéptido.

28. El método de la reivindicación 27, que comprende además la etapa de recuperar dicho polipéptido de dicho medio de cultivo.

29. El método de la reivindicación 28, en el que el polipéptido se purifica.

30. Una composición que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

31. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25 para usarse como un medicamento.

32. El uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.

33. El uso de la reivindicación 32, en el que la enfermedad neurodegenerativa implica neuronas lesionadas y traumáticas.

34. El uso de la reivindicación 33, en el que las neuronas lesionadas y traumáticas se seleccionan de una o más de las lesiones traumáticas de nervios periféricos, el bulbo raquídeo y la médula espinal.

35. El uso de la reivindicación 32, en el que la enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en lesión neuronal isquémica cerebral; neuropatía, neuropatía periférica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica y deterioro de la memoria asociado a la demencia.

36. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, en el que la enfermedad neurodegenerativa es neuropatía periférica.

37. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25 para usarse en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.

38. El polipéptido de la reivindicación 37, en el que la enfermedad neurodegenerativa implica neuronas lesionadas y traumáticas.

39. El polipéptido de la reivindicación 38, en el que las neuronas lesionadas y traumáticas se seleccionan de una o más de las lesiones traumáticas de nervios periféricos, el bulbo raquídeo y la médula espinal.

40. El polipéptido de la reivindicación 37, en el que la enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en lesión neuronal isquémica cerebral; neuropatía, neuropatía periférica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica y deterioro de la memoria asociado a la demencia.

41. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 37 a 40, en el que la enfermedad neurodegenerativa es neuropatía periférica.

42. Una secuencia de ácido nucleico cebador de PCR que consiste en una cualquiera de las secuencias mostradas en SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 23, 24, 25, 26 ó 28.

43. Un método para producir uno cualquiera de los polipéptidos mostrados en SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 6 ó 7, que comprende cultivar una célula que contiene una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mostradas en SEQ ID NOs: 1 ó 3 bajo condiciones que permitan la producción del polipéptido y recuperar el polipéptido del medio de cultivo.

44. Un método para producir un polipéptido de Neublastina de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, comprendiendo el método:

(a) introducir un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que codifica cuando se expresa un polipéptido de Neublastina en una célula o introducir una secuencia reguladora por recombinación homóloga en una células, de manera que la secuencia reguladora regule la expresión de un gen de Neublastina endógeno, para obtener una célula que produce Neublastina;

(b) cultivar la célula que produce Neublastina bajo condiciones de cultivo que resulten en la expresión de un polipéptido de Neublastina.

45. Un gen sintético que codifica un polipéptido de Neublastina, comprendiendo el gen sintético una secuencia mostrada en SEQ ID NOs: 29 ó 30.

46. Un péptido de Neublastina que consiste en cualquiera de las secuencias siguientes:

GPGSRARAAGARGC (A.

3. 43 de SEQ ID NO: 9) ; LGHRSDELVRFRFC (A.

5. 70 de SEQ ID NO: 9) ; CRRARSPHDLSL (A.

7. 85 de SEQ ID NO: 9) ; LRPPPGSRPVSQPC (A.

9. 107 de SEQ ID NO: 9) ; STWRTVDRLSATAC (A.

12. 136 de SEQ ID NO: 9) ;

CRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFC (A.

4. 70 de SEQ ID NO: 9) ; CRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPC (A.

7. 107 de SEQ ID NO: 9) ; CRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATAC (A.

10. 136 de SEQ ID NO: 9) ; CRPTRYEAVSFMDVNST (A.

10. 124 de SEQ ID NO: 9) ; o ALRPPPGSRPVSQPC (A.

9. 107 de SEQ ID NO: 9) .

47. Un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de los péptidos de la reivindicación 46.