Un procedimiento de una etapa para producir un jarabe de glucosa a partir de una suspensión de almidón granular,

comprendiendo dicho procedimiento:

poner en contacto una suspensión de almidón granular obtenida a partir de un sustrato de almidón granular simultáneamente con una alfa-amilasa y una glucoamilasa que tiene actividad hidrolizante de almidón granular (GSHE) a una temperatura igual a o inferior a la temperatura de gelatinización del almidón granular; y

permitir que la alfa-amilasa y la GSHE actúen durante un periodo de tiempo suficiente para hidrolizar el almidón granular para obtener una composición que comprende un jarabe de glucosa,

en el que la GSHE se obtiene a partir de la expresión heteróloga de un polinucleótido que codifica una GSHE que tiene al menos el 95% de identidad de secuencias con la secuencia de SEQ ID NO: 3,

en el que la alfa-amilasa se deriva de Bacillus stearothermophilus o un mutante recombinante del mismo, y en el que la suspensión de almidón granular tiene un contenido de sólidos secos del 15 - 55%.

Expresión de enzimas hidrolizantes de almidón granular en trichoderma y procedimiento para producir glucosa a partir de sustratos de almidón granular

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere además al uso de GSHE en procedimientos para producir jarabe de glucosa y otros productos finales a partir de sustratos de almidón granular que comprenden poner en contacto un sustrato de almidón granular, a o por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular, simultáneamente con una amilasa licuefactora de almidón y una GSHE.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La fermentación industrial usa predominantemente glucosa como materia prima para la producción de una multitud de proteínas, enzimas, aminoácidos, alcoholes, ácidos orgánicos, productos farmacéuticos y otros productos químicos. En muchas aplicaciones, la glucosa se produce a partir de la conversión enzimática de sustratos de carbono tales como biomasa y almidón. El almidón, que se encuentra abundantemente en plantas verdes, se acumula como gránulos microscópicos variando en diámetro de 0, 5 a 175 micrómetros. La naturaleza cristalina parcial de estos gránulos de almidón confiere insolubilidad en agua fría. Como resultado, la solubilización de gránulos de almidón en agua requiere una tremenda cantidad de energía calorífica para romper la estructura cristalina del gránulo produciendo la solubilización del almidón parcialmente hidrolizado. Se han empleado numerosos procedimientos de solubilización y éstos incluyen sistemas de calentamiento directo e indirecto tales como calentamiento directo por inyección de vapor (véase, por ejemplo, STARCH CHEMISTRY AND TECHNOLOGY, eds R. L. Whistler y col., 2ª ed.; 1984, Academic Press Inc., Orlando, FL; STARCH CONVERSION TECHNOLOGY, Eds. G.M.A. Van Beynum y col., Food Science and Technology Series, Marcel Dekker Inc., NY; y THE ALCOHOL TEXTBOOK, 3ª ed., Eds. K. Jacques, T.P. Lyons y D.R. Kelsall, 1999, Nottingham University Press, RU) .

En general, se han usado etapas de dos enzimas para la hidrólisis del almidón en glucosa. La primera etapa es una etapa de licuefacción y la segunda etapa es una etapa de sacarificación. En la etapa de licuefacción, los gránulos de almidón insolubles se suspenden en agua, se gelatinizan con calor y se hidrolizan por una alfaamilasa termoestable (EC 3.2.1.1, alfa- (1-4) -glucano-glucanohidrolasa) en presencia de calcio añadido para producir un puré de dextrinas. El puré resultante se enfría generalmente a aproximadamente 60 a 65ºC. En la etapa de sacarificación, las dextrinas solubles (azúcares) se hidrolizan adicionalmente en dextrosa (glucosa) por una enzima que tiene actividad de glucoamilasa (EC 3.2.1.3, alfa- (1, 4) -glucano-glucohidrolasa) . Entonces, la glucosa puede usarse como producto final o usarse como un precursor para convertirse en otros productos finales deseados comercialmente importantes tales como productos intermedios de fructosa, sorbitol, etanol, ácido láctico, ácido ascórbico (ASA) y 1, 3-propanodiol.

A finales de los años 50 se comercializaron glucoamilasas derivadas de Aspergillus niger, y estas enzimas mejoraron significativamente la conversión del almidón en glucosa. Otra mejora significativa producida en los años 70. Una alfa-amilasa termoestable que tiene termoestabilidad mejorada, estabilidad al pH y menor dependencia del calcio se derivó y se comercializó de Bacillus licheniformis (documento USP 3.912.590) .

La industria de los edulcorantes del almidón ha adoptado otros procedimientos industriales para el procedimiento de licuefacción de enzimas (documento USP 5.322.778) . Algunos de estos procedimientos incluyen un procedimiento a baja temperatura (105 -110ºC durante 5 - 8 min) con menores requisitos de vapor y un procedimiento a alta temperatura (148ºC +/-5ºC durante 8 -10 s) que mejora la gelatinización de los gránulos de almidón produciendo características y calidad de filtración mejoradas del sustrato de almidón licuado (Shetty y col., (1988) Cereal Foods World 33:929-934) .

Aunque los procedimientos de licuefacción del almidón con enzimas están muy establecidos, serían deseables mejoras con respecto a la pérdida de rendimiento, costes de procesamiento, consumo de energía, ajustes de pH, umbrales de temperatura, requisito de calcio y niveles de almidón retrogradado. En particular, es muy conocido que la alfa-amilasa residual de la etapa de licuefacción, bajo condiciones de sacarificación, tenga un efecto adverso sobre la eficiencia del procedimiento y que la alfa-amilasa residual deba inactivarse antes de la sacarificación por glucoamilasas. La inactivación se realiza generalmente reduciendo el pH del almidón licuado a pH 4, 2 a 4, 5 a 95ºC. Otra desventaja de los procedimientos de licuefacción es la isomerización alcalina de grupos reductores. La isomerización alcalina produce la formación de un disacárido, la maltulosa (4-alfa-D-glucopiranosil-Dfructosa) . La maltulosa reduce el rendimiento de la glucosa debido a que es resistente a la hidrólisis por glucoamilasas y alfa-amilasas. Además, es difícil de controlar la formación de productos de inversión de la reacción catalizada por glucoamilasas activas a alta concentración de glucosa. Las glucoamilasas de Aspergillus niger son generalmente termoestables bajo las condiciones de sacarificación típicas.

Por tanto, una cantidad sustancial de la actividad de glucoamilasa puede continuar después de la reacción de sacarificación. Diversos investigadores han sugerido soluciones a algunos de los problemas que se tratan en este documento.

Por ejemplo, Leach y col. (documentos USP 4.113.509 y USP 3.922.196) desvelan un procedimiento para convertir almidón granular (refinado) en hidrolizado soluble incubando el almidón granular con alfa-amilasa bacteriana a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón. Luego se usó beta-amilasa para la hidrólisis para producir jarabe de alta maltosa.

La solicitud de patente europea nº 0350737 A2 desvela un procedimiento para producir jarabe de maltosa hidrolizando un almidón granular (purificado) de maíz, trigo, patata y boniato a 60ºC sin la etapa de licuefacción convencional (gelatinización seguida de licuefacción a alta temperatura) usando una alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus.

Previamente se ha descrito un procedimiento de múltiples etapas para convertir almidón granular (bruto) en glucosa usando una glucoamilasa que demuestra capacidad de hidrólisis de almidón bruto (documento USP 4.618.579) . Sin embargo, sólo se hidrolizó el 60% del almidón, que luego produjo un amplio procedimiento de recirculación.

El documento WO 03/068976 se refiere a procedimientos que emplean una primera enzima que es un miembro de la familia 13 de las glucósido hidrolasas, y particularmente una ciclodextrina gluconotransferasa (CGTasa) , junto con una o más enzimas adicionales, y enseña que con el fin de conseguir altos niveles de producción de glucosa en un procedimiento de una única etapa debería emplearse una CGTasa.

Karakatsanis y col. (Starch, 49:194-199, 1997) y Fujii y Kawamura (Biotech. Bioeng. XXVII: 260-265, 1985) desvelan experimentos en los que se investigan la acción de una alfa-amilasa y una glucoamilasa sobre un sustrato de almidón soluble.

Liakopoulou-Kyrikides y col. (Cereal Chem., 78 (5) : 603-607, 2001) informan de experimentos en los que un sustrato de almidón granular se trató con una combinación de una a-amilasa de Bacillus licheniformis y una glucoamilasa del moho Rhizopus. El resumen informa de una velocidad de conversión del 76% a 50ºC.

No sólo sería ventajoso mejorar los procedimientos convencionales para la conversión del almidón granular, sino que también se desearía proporcionar procedimientos que producen un aumento de la expresión y producción de la enzima luego usada. Por ejemplo, las glucoamilasas que tienen actividad hidrolizante de almidón granular con características mejoradas tales como elevada actividad específica, diferentes intervalos de pH y/o diferentes niveles de glucosilación pueden ser particularmente ventajosas para su uso en la conversión de almidón industrial. La presente invención no sólo satisface algunas de estas necesidades, sino que también produce un aumento en la eficiencia de producción de diversos productos finales obtenidos a partir de la hidrólisis del almidón.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Por consiguiente, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de una etapa para producir... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de una etapa para producir un jarabe de glucosa a partir de una suspensión de almidón granular, comprendiendo dicho procedimiento:

poner en contacto una suspensión de almidón granular obtenida a partir de un sustrato de almidón granular simultáneamente con una alfa-amilasa y una glucoamilasa que tiene actividad hidrolizante de almidón granular (GSHE) a una temperatura igual a o inferior a la temperatura de gelatinización del almidón granular; y permitir que la alfa-amilasa y la GSHE actúen durante un periodo de tiempo suficiente para hidrolizar el almidón granular para obtener una composición que comprende un jarabe de glucosa, en el que la GSHE se obtiene a partir de la expresión heteróloga de un polinucleótido que codifica una GSHE que tiene al menos el 95% de identidad de secuencias con la secuencia de SEQ ID NO: 3, en el que la alfa-amilasa se deriva de Bacillus stearothermophilus o un mutante recombinante del mismo, y en el que la suspensión de almidón granular tiene un contenido de sólidos secos de.

15. 55%.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el sustrato de almidón granular se obtiene a partir de maíz, trigo, cebada o arroz.

3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que el sustrato de almidón granular es almidón de maíz obtenido a partir de grano completo.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el sustrato de almidón granular se muele en seco

o se muele en húmedo.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la suspensión de almidón granular tiene un contenido de sólidos secos de.

15. 45%.

6. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento se lleva a cabo a un pH de entre 4, 5 y 6, 5.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que:

(a) la temperatura es inferior a 65ºC y superior a 50ºC; o

(b) la temperatura es inferior a 65ºC y superior a 55ºC; o

(c) el periodo de tiempo suficiente para hidrolizar el almidón granular es de 2 a 100 horas; o

(d) la etapa de poner en contacto se realiza a un pH de 5, 0 a 6, 0.

8. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que:

(a) la cantidad de alfa-amilasa por tonelada métrica de almidón está en el intervalo de 0, 05 a 5, 0 kg; o

(b) la cantidad de alfa-amilasa por tonelada métrica de almidón está en el intervalo de 0, 05 a 2, 0 kg.

9. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la GSHE tiene al menos el 98% de identidad de secuencias con la secuencia de SEQ ID NO: 3.

10. El procedimiento según la reivindicación 9 en el que la GSHE tiene al menos el 99% de identidad de secuencias con la secuencia de SEQ ID NO: 3.

11. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que:

(a) la cantidad de GSHE está en el intervalo de 0, 01 a 10, 0 U de GSHE/g de sólidos secos de almidón; o

(b) la cantidad de GSHE está en el intervalo de 0, 1 a 5, 0 unidades de GSHE/g de sólidos secos de almidón; o

(c) la cantidad de GSHE está en el intervalo de 0, 25 a 2, 5 unidades de GSHE/g de sólidos secos de almidón.

12. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que al menos el 90% del almidón granular se hidroliza dentro de 24 horas.

13. El procedimiento según la reivindicación 1 que comprende además:

(a) recuperar el jarabe de glucosa; y/o

(b) convertir el jarabe de glucosa en un producto final deseado.

14. El procedimiento según la reivindicación 13, en el que el jarabe de glucosa se recupera por separación por filtración.

15. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que el producto final deseado es un jarabe de fructosa o el producto final deseado es etanol o el producto final deseado es una glucosa cristalizada.

16. El procedimiento según la reivindicación 14, en el que almidón residual se obtiene como un producto de la separación del jarabe de glucosa.

17. El procedimiento según la reivindicación 16 que comprende además recircular el almidón residual poniendo en contacto el almidón residual con la GSHE y alfa-amilasa a una temperatura por debajo de la temperatura de gelatinización del almidón granular.

18. Un procedimiento para la producción de un jarabe basado en almidón de alta fructosa que comprende:

(a) un procedimiento de una etapa para producir un jarabe de glucosa a partir de una suspensión de almidón granular como se define en la reivindicación 1; y

(b) convertir enzimáticamente el jarabe de glucosa producido en la etapa (a) en un jarabe de fructosa.

19. El procedimiento según la reivindicación 18, en el que la etapa de conversión incluye el uso de una glucosa isomerasa.

20. Un procedimiento para la producción de una composición de almidón residual que comprende:

(a) un procedimiento de una etapa para producir un jarabe de glucosa a partir de una suspensión de almidón granular como se define en la reivindicación 1; y

(b) separar el jarabe de glucosa de la composición para obtener una mezcla que incluye almidón residual.

21. Un procedimiento para la producción de etanol que comprende:

(a) un procedimiento de una etapa para producir un jarabe de glucosa a partir de una suspensión de almidón granular como se define en la reivindicación 1;

(b) someter el jarabe de glucosa a fermentación con un microorganismo etanolgénico para producir etanol.

22. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que la fermentación se lleva a cabo por separado y secuencialmente a la etapa de poner en contacto.

23. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que la fermentación se lleva a cabo simultáneamente a la etapa de poner en contacto.

24. El procedimiento según la reivindicación 21 que comprende además recuperar el etanol de la fermentación.