Evento de algodón MON 88913 y composiciones y procedimientos para su detección.

Una planta de algodón tolerante al glifosato, o partes de la misma,

o una semilla de la misma, el genoma de la cual comprende

(i) una inserción de ADN que comprende un primer cassette de expresión que comprende un promotor 1-alfa del factor de alargamiento del virus-Arabidopsis del mosaico Figwort quimérico (FMV35S/Eflα), operativamente unido al líder de la traducción 1-alfa de alargamiento de Arabidopsis e intrón, operativamente unido al péptido de tránsito al cloroplasto 5-enol-piruvilsiquimato-3-fosfasto sintasa (EPSPS) de Arabidopsis, operativamente unido a un EPSPS tolerante al glifosato de la cepa CP4 de la especie Agrobacterium, operativamente unido a la región de terminación 3' de ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa E9 de guisante, y un segundo cassette de expresión que comprende el promotor CaMV35S-Act8 incluyendo el primer intrón del gen Act8, operativamente conectado a un péptido de tránsito al cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis, operativamente conectado a un EPSPS tolerante al glifosato de la cepa CP4 de la especie Agrobacterium, operativamente unido a la región de terminación 3' de ribulosa 1,5- bisfosfato carboxilasa E9 de guisante, y

una o más secuencias de unión de genómica/transgén seleccionadas de la SEC ID N°: 1, SEC ID N°: 2, SEC ID N° : 3 y SEC ID N°: 4 cubriendo el sitio de inserción que comprende la inserción de ADN en el genoma de algodón, y (ii) siendo la planta de algodón tolerante al glifosato, o partes de la misma o una semilla de la misma la progenie de la planta de algodón cultivada a partir de semillas del evento de algodón MON88913 según lo depositado en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (ATCC) con Núm. de referencia PTA-4854.

Evento de algodón MON 88913 y composiciones y procedimientos para su detección Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la biología molecular vegetal. Más específicamente, la invención se refiere a un evento de algodón tolerante al glifosato MON 88913 y a ensayos y procedimientos para detectar la presencia de ADN del evento de algodón MON 88913 en una muestra vegetal y composiciones del mismo.

Antecedentes de la invención El algodón es un cultivo de fibra importante en muchas áreas del mundo. Los procedimientos de la biotecnología se han aplicado a algodón para la mejora de las características agronómicas y la calidad del producto. El procedimiento de introducción de transgenes en las plantas de algodón se ha demostrado la Patente Estadounidense Núm.

5.004.863. Un rasgo agronómico importante en la producción de algodón es la tolerancia a herbicidas, en particular, la tolerancia al herbicida glifosato. Esta característica ha sido introducida en las plantas de algodón y es un producto de éxito ahora utilizado en la producción de algodón. El evento de algodón comercial actual (1445) Ready® de Roundup proporciona excelente tolerancia al glifosato, el ingrediente activo en Roundup®, a través de la etapa de cuatro hojas (Nida et al., J. Agric. Food Chem. 44:1960-1966, 1996; Nida et al., J. Agric. Food Chem. 44:1967-1974, 1996) . Sin embargo, debe limitarse la aplicación foliar más allá de la etapa de cuatro hojas debido a insuficiente tolerancia en tejidos reproductivos masculinos en ciertas condiciones. Esta falta de tolerancia reproductiva masculina parece ser el resultado de expresión insuficiente de CP4 PEPS en tejidos críticos, mayor sensibilidad de estos tejidos al glifosato y la acumulación de grandes cantidades de glifosato en estos tejidos de fuerte sumidero (Pline et al., Weed Sci. 50:438-447, 2002) . Existe la necesidad de una planta de algodón más altamente tolerante al glifosato que el algodón 1445 Ready® de Roundup.

Sería ventajoso para ser capaz de detectar la presencia de un evento concreto a fin de determinar si la progenie de un cruzamiento sexual contiene un transgén de interés. Además, un procedimiento para detectar un evento concreto sería útil para el cumplimiento de reglamentaciones que requieren aprobación de premercado o marcado de los alimentos derivados de plantas de cultivo recombinante, por ejemplo. Es posible detectar la presencia de un transgén por cualquier procedimiento de detección de ácidos nucleicos bien conocido, como la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o hibridación de ADN utilizando sondas de ácidos nucleicos. Estos procedimientos de detección suelen centrarse en elementos genéticos utilizados con frecuencia, tales como promotores, terminadores de transcripción 3', genes marcadores, etc. Como resultado, tales procedimientos pueden no ser útiles para discriminar entre los diferentes eventos, especialmente los que se producen usando la misma construcción de ADN a menos que se conozca la secuencia de ADN genómico cromosómico adyacente al ADN insertado ("ADN genómico flanqueante") . Se han descrito procedimientos de detección de ADN específicos del evento para un evento de algodón 1445 tolerante al glifosato (documento US 20020120964 y documento WO 0234946) . Una secuencia de ADN que tiene superposición de 646 nt con la secuencia de unión de la SEC ID N°: 3 se divulga en el docum ento US

6.462.258.

La presente invención se refiere a un evento de algodón tolerante al glifosato MON 88913, composiciones contenidas en el mismo, y al procedimiento para la detección de la región de inserción del transgén/genómica en el evento de algodón MON 88913 y su progenie.

Sumario de la invención La presente invención proporciona una planta de algodón tolerante al glifosato, o partes de la misma o una semilla de la misma, el genoma de la cual comprende:

(i) Una inserción de ADN que comprende un primer cassette de expresión que comprende un promotor 1-alfa del factor de alargamiento del virus-Arabidopsis del mosaico Figwort quimérico (FMV35S/Efla) , operativamente unido al líder de la traducción 1-alfa de alargamiento de Arabidopsis e intrón, operativamente unido al péptido de tránsito al cloroplasto 5-enol-piruvilsiquimato-3-fosfasto sintasa (EPSPS) de Arabidopsis, operativamente unido a un EPSPS tolerante al glifosato de la cepa CP4 de la especie Agrobacterium, operativamente unido a la región de terminación 3' de ribulosa 1, 5-bisfosfato carboxilasa E9 de guisante, y un segundo cassette de expresión que comprende el promotor CaMV35S-Act8 incluyendo el primer intrón del gen Act8, operativamente conectado a un péptido de tránsito al cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis, operativamente conectado a un EPSPS tolerante al glifosato de la cepa CP4 de la especie Agrobacterium, operativamente unido a la región de terminación 3' de ribulosa 1, 5bisfosfato carboxilasa E9 de guisante, y

(ii) una o más secuencias de unión de transgén/genómica seleccionadas de la SEC ID N°: 1, SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 3 y SEC ID N°: 4 cubriendo el sitio de inserci ón que comprende la inserción de ADN en el genoma de algodón. Las partes de la planta incluyen polen, óvulo, flores, cápsulas, fibra, brotes, raíces y hojas. La invención se refiere a una progenie de la planta de algodón tolerante al glifosato anterior que comprende una inserción de ADN y secuencia de unión al transgén/genoma según lo definido más arriba.

Otro aspecto de la invención proporciona un conjunto de cebadores de ADN que comprende dos moléculas de ADN, en el que

(i) la primera molécula de ADN comprende al menos 11 o más nucleótidos contiguos de cualquier porción de la región transgén de la molécula de ADN de la SEC ID N°: 3 o su complemento, y la segunda molécula de ADN de longitud similar comprende cualquier porción de la región de ADN genómico de algodón flanqueante 5' comprendida dentro de la SEC ID N°: 3 o su complemento, en la que la primera y segunda moléculas de ADN se reasocian a hebras opuestas de la SEC ID N°: 3 y en la que los ex tremos 3' de la primera y segunda moléculas de ADN están orientadas una hacia la otra; o

(ii) la primera molécula de ADN comprende al menos 11 o más nucleótidos contiguos de cualquier porción de la región del transgén de la molécula de ADN de la SEC ID N°: 4, o su complemento, y la segunda molécula de ADN de longitud similar comprende cualquier porción de la región de ADN genómico de algodón flanqueante 3' comprendida dentro de la SEC ID N°: 4, su complemento , reasociándose la primera y segunda moléculas de ADN a hebras opuestas de la SEC ID N°: 4 y estando orientad os los extremos 3' de la primera y segunda moléculas de ADN uno hacia el otro,

produciendo dicho conjunto de cebadores, cuando se utiliza en un procedimiento de amplificación de ADN, un amplicón que comprende la SEC ID N°: 1 o SEC ID N°: 2 de diagnóstico para MON88913.

En conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona un kit de detección de ADN que comprende el conjunto de cebadores anterior.

En conformidad con otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ADN que comprende una secuencia seleccionada de la SEC ID N°: 1, SEC ID N°: 2 , SEC ID N°: 3 y SEC ID N°: 4.

En conformidad con otro aspecto de la invención, se proporcionan procedimientos para detectar la presencia de ADN que corresponda específicamente al ADN del evento de algodón MON 88913 en una muestra. Dichos procedimientos comprenden: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con un conjunto de cebadores de ADN que, cuando se utiliza en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico del evento de algodón MON 88913 produce un amplicón que es diagnóstico del evento de algodón MON 88913 (b) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de ese modo el amplicón; y (c) detectar el amplicón.

En conformidad con otro aspecto de la invención, se proporcionan procedimientos para detectar la presencia de ADN que corresponda específicamente al ADN del evento de algodón MON 88913 en una muestra. Dichos procedimientos comprenden: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda de ADN que comprende la SEC ID N°: o SEC ID N°: 2 que se hibrida e n condiciones de hibridación rigurosas con ADN genómico del evento de algodón MON 88913 y no se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con un ADN de planta de algodón de control; (b) someter la muestra y sonda a condiciones de hibridación rigurosas; y (c) detectar la hibridación de la sonda respecto del ADN del evento de algodón MON... [Seguir leyendo]

1. Una planta de algodón tolerante al glifosato, o partes de la misma, o una semilla de la misma, el genoma de la cual comprende

(i) una inserción de ADN que comprende un primer cassette de expresión que comprende un promotor 1-alfa del factor de alargamiento del virus-Arabidopsis del mosaico Figwort quimérico (FMV35S/Efla) , operativamente unido al líder de la traducción 1-alfa de alargamiento de Arabidopsis e intrón, operativamente unido al péptido de tránsito al cloroplasto 5-enol-piruvilsiquimato-3-fosfasto sintasa (EPSPS) de Arabidopsis, operativamente unido a un EPSPS tolerante al glifosato de la cepa CP4 de la especie Agrobacterium, operativamente unido a la región de terminación 3' de ribulosa 1, 5-bisfosfato carboxilasa E9 de guisante, y un segundo cassette de expresión que comprende el promotor CaMV35S-Act8 incluyendo el primer intrón del gen Act8, operativamente conectado a un péptido de tránsito al cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis, operativamente conectado a un EPSPS tolerante al glifosato de la cepa CP4 de la especie Agrobacterium, operativamente unido a la región de terminación 3' de ribulosa 1, 5bisfosfato carboxilasa E9 de guisante, y

una o más secuencias de unión de genómica/transgén seleccionadas de la SEC ID N°: 1, SEC ID N°: 2, SEC ID N° : 3 y SEC ID N°: 4 cubriendo el sitio de inserción que comprende la inserción de ADN en el genoma de algodón, y

(ii) siendo la planta de algodón tolerante al glifosato, o partes de la misma o una semilla de la misma la progenie de la planta de algodón cultivada a partir de semillas del evento de algodón MON88913 según lo depositado en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (ATCC) con Núm. de referencia PTA-4854.

2. La planta de algodón tolerante al glifosato, o parte de la misma, o semilla de la misma de la reivindicación 1, en la que dicha inserción de ADN tiene uniones 5' y 3' con el ADN genómico de algodón que están compuestas por la SEC ID N°: 1 y SEC ID N°: 2, respectivamente.

3. La planta de algodón tolerante al glifosato, o parte de la misma de la reivindicación 2, en la que las uniones 5' y 3' de dicha inserción de ADN con el ADN genómico de algodón están además compuestas por la SEC ID N°: 3 y SEC ID N°: 4, respectivamente.

4. La parte tolerante al glifosato de una planta de algodón de la reivindicación 1, seleccionándose la parte de planta de polen, óvulos, flores, cápsulas, fibra, brotes, raíces y hojas.

5. La planta de algodón tolerante al glifosato, o parte de la misma, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el ADN genómico de dicha planta de algodón, o parte de la misma, es capaz de producir al menos un amplicón que comprende la SEC ID N°: 1 o SEC ID N°: 2 d e diagnóstico de la inserción de ADN utilizando cebadores que tienen las secuencias de SEC ID N°: 21, SEC ID N°: 22 y SEC ID N°: 23 en un procedimiento de amplificación de ADN.

6. Una planta de algodón progenie tolerante al glifosato de la planta de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el genoma de la planta progenie una inserción de ADN y secuencias de unión genómicas/transgén según lo definido en las reivindicaciones 1 a 3.

7. Un conjunto de cebadores de ADN que comprende dos moléculas de ADN, en el que

(i) la primera molécula de ADN comprende al menos 11 o más nucleótidos contiguos de cualquier porción de la región del transgén de la molécula de ADN de la SEC ID N°: 3 o su complemento, y la segunda molécu la de ADN de longitud similar comprende cualquier porción de la región de ADN genómico de algodón flanqueante 5' comprendida dentro de la SEC ID N°: 3 o su complemen to, en la que la primera y segunda moléculas de ADN se reasocian a hebras opuestas de la SEC ID N°: 3 y en l a que los extremos 3' de la primera y segunda moléculas de ADN están orientadas una hacia la otra; o

(ii) la primera molécula de ADN comprende al menos 11 o más nucleótidos contiguos de cualquier porción de la región del transgén de la molécula de ADN de la SEC ID N°: 4, o su complemento, y la segunda moléc ula de ADN de longitud similar comprende cualquier porción de la región de ADN genómico de algodón flanqueante 3' comprendida dentro de la SEC ID N°: 4, o su complemen to, reasociándose la primera y segunda moléculas de ADN a hebras opuestas de la SEC ID N°: 4 y estando orient ados los extremos 3' de la primera y segunda moléculas de ADN uno hacia el otro,

produciendo dicho conjunto de cebadores, cuando se utiliza en un procedimiento de amplificación de ADN, un amplicón que comprende la SEC ID N°: 1 o SEC ID N°: 2 diagnóstico de MON88913.

8. Un kit de detección de ADN que comprende el conjunto de cebadores de ADN de la reivindicación 7.

9. Un procedimiento para detectar la presencia de un ADN correspondiente al evento de algodón MON 88913 en una muestra, estando dicho ADN presente en las semillas del evento de algodón MON88913 según lo depositado en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (ATCC) con Núm. de referencia PTA-4854, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con un conjunto de cebadores de ADN, que cuando se utiliza en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico del evento de algodón MON 88913 produce un amplicón de diagnóstico que comprende la SEC ID N°: 1 y SEC ID N°: 2; y

(b) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de ese modo el amplicón de diagnóstico; y

(c) detectar el amplicón de diagnóstico.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que la etapa de análisis se lleva a cabo realizando una reacción de amplificación de ácido nucleico utilizando un conjunto de cebadores que

(i) comprende la SEC ID N°: 21, SEC ID N°: 22 y SEC ID N° : 24; o

(ii) comprende la SEC ID N°: 26, SEC ID N°: 27 y SEC ID N °: 28.

11. Un procedimiento para detectar la presencia de un ADN correspondiente al evento de algodón MON 88913 en una muestra, estando dicho ADN presente en las semillas del evento de algodón MON88913 según lo depositado en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (ATCC) con Núm. de referencia PTA-4854, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con ADN genómico del evento de algodón MON 88913 y no se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con un ADN genómico de planta de algodón de control, comprendiendo dicha sonda una secuencia que es homóloga o complementaria a la SEC ID N°: 1 o SEC ID N°: 2; y

(b) someter la muestra y sonda a condiciones de hibridación rigurosas: y

(c) detectar la hibridación de la sonda al ADN.

12. Un procedimiento para determinar la zigosidad de la progenie del evento de algodón MON 88913, estando las semillas de dicho evento de algodón MON 88913 depositadas en la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo (ATCC) con Núm. de referencia PTA- 4854, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto una muestra que comprende ADN de algodón con un conjunto de cebadores que comprende la SEC ID N°: 21, SEC ID N°: 22 y SEC ID N°: 23 , SEC ID N°: 24 y SEC ID N°: 25 ; y

(b) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico; y

(c) detectar los productos de la reacción.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, que comprende un procedimiento para determinar la zigosidad de la progenie del evento de algodón MON 88913 que comprende:

(a) poner en contacto la muestra que comprende ADN de algodón con un conjunto de cebadores que comprende la SEC ID N°: 21, SEC ID N°: 22 y SEC ID N°: 23 , que cuando se utiliza en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico del evento de algodón MON 88913, produce un primer amplicón que es diagnóstico del evento de algodón MON 88913; y

(b) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de ese modo el primer amplicón;

(c) detectar el primer amplicón; y

(d) poner en contacto la muestra que comprende ADN de algodón con dicho conjunto de cebadores, que cuando se utiliza en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico de plantas de algodón produce un segundo amplicón que comprende el ADN genómico de algodón original homólogo a la región genómica de algodón de una inserción de transgén identificada como evento de algodón MON 88913;

(e) llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de ese modo el segundo amplicón; y

(f) detectar el segundo amplicón; y

(g) comparar el primer y segundo amplicones en una muestra, indicando la presencia de ambos amplicones que la muestra es heterocigota para la inserción del transgén.

14. Un procedimiento para combatir malezas en un cultivo de plantas de algodón tolerantes al glifosato en

conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la etapa de aplicar una dosis efectiva de un herbicida que contiene glifosato a dicho cultivo de plantas de algodón.

15. Una molécula de ADN que comprende una secuencia seleccionada de la SEC ID N°: 1, SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 3 y SEC ID N°: 4.

16. La molécula de ADN de la reivindicación 15, en la que la secuencia comprende la SEC ID N°: 1.

17. La molécula de ADN de la reivindicación 15, en la que la secuencia comprende la SEC ID N°: 2.

18. La molécula de ADN de la reivindicación 15, en la que la secuencia comprende la SEC ID N°: 3.

19. La molécula de ADN de la reivindicación 15, en la que la secuencia comprende la SEC ID N°: 4.