Un procedimiento de evaluación de posibles tratamientos para determinar su actividad contra priones oenfermedades relacionadas con priones,

que se caracteriza por:

someter un modelo de priones a un tratamiento, aplicándose el modelo de priones a un sustrato, en el que elmodelo de priones comprende un organismo dependiente de fluido ileal (IFDO) que se ha demostrado queexhibe una respuesta similar a la de los priones a un tratamiento diseñado para atacar priones, en el que eltratamiento incluye: limpiar el sustrato con una composición de limpieza alcalina que tiene una concentraciónde álcali de 0,02 a 0,1M y que elimina las proteínas, y poner en contacto el sustrato limpiado con un agenteoxidante que contiene ácido peracético; y evaluar el efecto del tratamiento sobre el modelo de priones comoindicador del efecto del tratamiento sobre el prión o la enfermedad relacionada con priones.

Procedimiento de evaluación in vitro para tratamientos priocidaces (anti-priones)

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al campo de las enfermedades infecciosas. Encuentra aplicación concreta como

procedimiento de evaluación de la respuesta de priones (agentes infecciosos proteináceos) a varios tratamientos y se describirán con referencia concreto al mismo. No obstante, se apreciará que la invención también es aplicable a otros estudios de la actividad de los priones.

El término “Prión” se usa para describir agentes infecciosos proteináceos que producen enfermedades cerebrales similares en seres humanos y/o en animales, que son, invariablemente, mortales. En general, estas enfermedades 10 se denominan encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) . Las EST incluyen la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) y sus variantes CJD vCJD) en seres humanos, encefalopatía espongiforme bovina (BSE) en ganado vacuno, también conocida como “enfermedad de las vacas locas”, scrapie en ovejas y caquexia en el alce. Todas estas enfermedades atacan a los órganos neurológicos del animal o animales que son susceptibles a la enfermedad concreta. Se caracterizan por tiempos de incubación inicialmente largos seguidos por un período corto

de síntomas neurológicos, incluyendo demencia y pérdida de coordinación, y, en última instancia, muerte.

Se cree que el agente infeccioso responsable de estas enfermedades es una proteína simple, sin ácidos nucleicos asociados. Se ha propuesto que el mecanismo patógeno para tales enfermedades de priones implica una proteína codificada por el huésped normal inicial. La proteína experimenta un cambio conformacional a una forma anormal (un prión) , que tiene la capacidad de auto-propagación. La causa exacta de este cambio es actualmente

desconocida. La forma anormal de la proteína no se descompone eficazmente en el cuerpo y su acumulación en ciertos tejidos (en particular tejido neural) causa, en última instancia, daños en de tejidos, tal como muerte celular. Una vez que se ha producido daño de tejido neural significativo se observan los signos clínicos.

Por tanto, las enfermedades de priones pueden clasificarse como enfermedades de agregación de proteínas, que incluyen también otras varias enfermedades fatales, tales como la enfermedad de Alzheimer y la amiloidosis. En el 25 caso de la CJD, la enfermedad de priones más frecuente en seres humanos (que se producen en aproximadamente

1:1.000.000 de la población) , se piensa que aproximadamente el 85% de los casos surge esporádicamente, se cree que aproximadamente 10% es hereditario y aproximadamente el 5% surge iatrogénicamente.

En la actualidad no se conocen tratamientos eficaces para las enfermedades de priones en animales o seres humanos y, por tanto, tras el inicio de los síntomas neurológicos se produce la muerte. El progreso en la 30 identificación de fármacos terapéuticos diana ha sido lento debido a la incapacidad para realizar pruebas in vitro. Hasta la fecha no se han desarrollado procedimientos para cultivar priones en medios en el laboratorio. Estudios in vivo implican la inoculación de priones en un animal de ensayo y analizar la respuesta del animal a un régimen terapéutico propuesto. Dado que la progresión de la enfermedad es lenta, estos estudios un vivo son, inevitablemente, largos y, por tanto, no es fácil la realización de la detección selectiva de un número elevado de

posibles fármacos. Modelos de ratón o hámster in vivo se han sometido a ingeniería genética para que sean más susceptibles a los priones y, en general, se usan para evaluaciones. Además, dado que estas enfermedades tienden a ser específicas de animales, no se sabe si los ensayos realizados en animales se pueden aplicar fácilmente a seres humanos.

Algunos grupos de investigación se han sugerido usando un modelo de priones en levaduras para evaluación de

fármacos y se han producido algunos informes de un modelo in vitro para estudiar el plegamiento de los priones. No obstante, no hay estudios que hayan establecido correlaciones entre el comportamiento de estos modelos propuestos y la actividad de los priones.

A principios de la década de 1980 se aisló un nuevo agente de replicación del tracto intestinal humano. (Burdon, J. Med. Micro., 29: 145-157 (1989) y Burdon; The Lancet, Vol. 353; April 10 (1999) ) . Este agente se aisló del fluido de 45 ileostomía (filtrado a través de un filtro de 0, 2 1) de dos pacientes con enfermedad de Crohn y se pudo cultivar in vitro. Se le ha dado el nombre de Organismo dependiente de fluido ileal (IFDO) , aunque después se ha descubierto que sobrevive en otros medios, como en presencia de pancreatina. Se observaron colonias marrones pequeñas sobre un medio de crecimiento específico selectivo. Al analizar este agente, no parecía tener naturaleza viral, bacteriana ni fúngica, pero sí parecía crecer logarítmicamente y tener una resistencia poco habitual a diversos

50 antibióticos y agentes físicos y químicos. También se descubrió que el agente tenía una elevada resistencia al calor húmedo. Este agente no se había relacionado antes directamente con priones ni se había usado en investigación con priones.

Aunque, en general, las enfermedades de priones no se han considerado muy contagiosas, se pueden transmitir dentro de la misma especie y, en determinadas condiciones, de una especie a otra. Recientemente se ha 55 demostrado que las enfermedades de priones se pueden transmitir a través de tejidos de riesgo, incluido el cerebro,

la médula espinal y los ojos. También se ha comunicado la transmisión iatrogénica, incluidos injerto de duramadre, trasplantes corneales, homoinjertos pericárdicos, y a través de contaminación de gonadotropina humana y de hormona del crecimiento humana. Se ha comunicado también la transmisión mediante dispositivos médicos, incluidos a través de la reutilización de instrumentos neuroquirúrgicos,

electrodos de profundidad y otros dispositivos usados durante cirugías en estrecha proximidad con el sistema nervioso central.

Actualmente se ha especulado mucho sobre la eficacia de la descontaminación convencional y los procedimientos de esterilización para la destrucción de priones. Los priones son considerablemente muy fuertes y demuestran resistencia a procedimientos de rutina de descontaminación y esterilización. Algunos procedimientos recomendados 10 incluyen incineración, esterilización con vapor en autoclave prolongada, tratamientos con hidróxido sódico e hipoclorito sódico a concentraciones elevadas (p. ej., NaOH 1M o NaHClO3 al 2 % Cl disponible durante 1 horas) . Estos tratamientos agresivos a menudo son incompatibles con los dispositivos médicos, endoscopios particularmente flexibles y otros dispositivos con partes de plástico, bronce o aluminio. Muchos dispositivos son dañados por la exposición a temperaturas elevadas. Los tratamientos químicos, como las bases fuertes, son

dañinos para los materiales del dispositivo médico o las superficies en general. En general, se ha comunicado que el glutaraldehído, el formaldehído, el peróxido de hidrógeno, la mayoría de los fenólicos, los alcoholes y procedimientos tales como calor seco, ebullición, congelación, UV, ionización y radiación con microondas son ineficaces. Existe una clara necesidad de productos y procedimientos que sean eficaces contra los priones, además de compatibles con las superficies.

Un tratamiento menos agresivo que se ha investigado y demostrado que es eficaz contra los priones es la formulación de ácido peracético formulada por STERIS Corporation, Mentor, Ohio, con la marca STERIS 20™. La formulación contiene ácido peracético mezclado con tampones, anticorrosivos, tensioactivos y quelantes, preparada en una dilución de uso para procesamiento estéril a temperaturas superiores a la ambiente.

No obstante, actualmente no hay ningún medio fácil de evaluación de tratamientos anti-priones (“priocidas”) , El

cultivo de dispositivos tratados con priones tras los tratamientos priocidas propuestos implica inocular a los animales con lavados procedentes de los dispositivos y observar el desarrollo de la enfermedad si el tratamiento priocida es ineficaz. Este es un proceso prolongado y susceptible a errores, ya que el número de priones que quedan en los dispositivos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de evaluación de posibles tratamientos para determinar su actividad contra priones o enfermedades relacionadas con priones, que se caracteriza por:

someter un modelo de priones a un tratamiento, aplicándose el modelo de priones a un sustrato, en el que el

modelo de priones comprende un organismo dependiente de fluido ileal (IFDO) que se ha demostrado que exhibe una respuesta similar a la de los priones a un tratamiento diseñado para atacar priones, en el que el tratamiento incluye: limpiar el sustrato con una composición de limpieza alcalina que tiene una concentración de álcali de 0, 02 a 0, 1M y que elimina las proteínas, y poner en contacto el sustrato limpiado con un agente oxidante que contiene ácido peracético; y evaluar el efecto del tratamiento sobre el modelo de priones como

indicador del efecto del tratamiento sobre el prión o la enfermedad relacionada con priones.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que además se caracteriza porque:

el tratamiento incluye tratar el modelo de priones con una solución de ácido peracético a una temperatura d.

5. 58 ºC.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, que además se caracteriza porque:

el modelo de priones contenido en un vaso incluye orificios a través de los cuales el descontaminante tiene acceso al vaso y un camino por el cual el descontaminante contacta con el modelo de priones.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que además se caracteriza porque:

el tratamiento incluye someter al modelo de priones a un procedimiento conocido porque es eficaz en la destrucción de microorganismos.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que además se caracteriza porque:

el tratamiento incluye tratar un dispositivo médico o farmacéutico que se ha contaminado con el modelo de priones con una composición que incluye al menos uno de nisina, manganeso y nitrato de plata.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que además se caracteriza porque: la etapa de evaluación incluye:

cultivar el modelo de priones restante en un medio de cultivo; y detectar el crecimiento del modelo de priones.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la etapa de evaluación incluye: cultivar el modelo de priones restante en un medio que contiene hemoglobina, y observar un cambio de color del medio como indicación de la cantidad del modelo de priones restante.

8. El procedimiento de la reivindicación 6 o 7, en el que la etapa de detectar incluye someter el modelo de priones cultivad a un procedimiento que detecta proteínas.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la etapa de detección incluye detectar fragmentos de proteinas.