Ensayo para detectar feromonas peptídicas natriuréticas auriculares y cerebrales.

Un método in vitro para determinar la activación o inactivación del sistema hormonal del péptido natriurético atrial (ANP) y del péptido natriurético cerebral (BNP),

comprendiendo el método detectar en forma simultánea en una sola lectura o resultado la presencia o la cantidad de prohormonas del péptido natriurético atrial y cerebral (proANP y proBNP) o fragmentos de las mismas en una muestra, dicho método comprendiendo:

(I) poner en contacto la muestra con una primera sustancia de enlazamiento bi u oligo-específica que es capaz de enlazarse tanto con: (a)

(i) proANP (SEQ ID NO: 1) , ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3) :

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y

(b)

(i) pro-BNP (SEQ ID NO: 4) , BNP (SEQ ID NO: 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6);

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i);

o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; o

(II) poner en contacto la muestra con -un agente que contiene: (a)

(i) proANP (SEQ ID NO: 1) , ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y

(b)

(i) pro-BNP (SEQ ID NO: 4) , BNP (SEQ ID NO: 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ;

o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y -una primera sustancia de enlazamiento que es capaz de enlazarse con:

(a)

(i) proANP (SEQ ID NO: 1) , ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3) ; (ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y

(b)

(i) pro-BNP (SEQ ID NO: 4) , BNP (SEQ ID NO. 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6) ; (ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o (iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y (c) el agente.

Ensayo para detectar feromonas peptídicas natriuréticas auriculares y cerebrales

Campo de técnico de la invención La invención se relaciona con métodos de ensayo útiles para el diagnóstico y/o el monitoreo del tratamiento de condiciones cardíacas tales como insuficiencia cardíaca y con sustancias para uso en los métodos Antecedentes de la invención La insuficiencia cardíaca congestiva (CHF) es un síndrome clínico provocado por una enfermedad cardíaca, caracterizada por falta de aliento y retención anormal de agua y sodio, y que trae como consecuencia edema. Esto se presenta cuando el corazón es incapaz de generar un gasto cardíaco suficiente para satisfacer las demandas del cuerpo sin un marcado incremento de la presión diastólica. Es una consecuencia de una enfermedad cardíaca que perjudica la función sistólica o diastólica ventricular, o ambas. No es una única enfermedad sino la etapa final de muchas formas diferentes de enfermedades del corazón, las más comunes de las cuales son las enfermedades de las arterias coronarias, hipertensión y diabetes (Kannel et al. 1994) . La insuficiencia cardíaca se manifiesta por síntomas de pobre perfusión tisular (por ejemplo, fatiga, pobre tolerancia al ejercicio) o congestión de los cauces vasculares (por ejemplo, disnea, edema pulmonar, edema periférico) o ambos. El tratamiento de la insuficiencia cardíaca se dirige en general hacia sus causas subyacentes.

La prevalencia de insuficiencia cardíaca sintomática en la población en general en Europa se estima que es aproximadamente del 0, 4 -2%. Como la prevalencia se eleva rápidamente con la edad, se espera que el incremento en las expectativas de vida tenga un mayor impacto sobre la incidencia de la insuficiencia cardíaca en el futuro próximo. La forma asintomática de la disfunción sistólica ventricular izquierda se estima que es tan común como insuficiencia cardíaca congestiva sintomática (McDonagh et al. 1997) .

Se ha encontrado que los parámetros actuales de la rutina clínica e investigativa utilizados para el diagnóstico de insuficiencia cardíaca (examen clínico, electrocardiografía, rayos X de tórax) son inadecuados debido a que el diagnóstico causa resultados que son falsos positivos (Remes et al. 1991) . La ecocardiografía proporciona información específica sobre el diagnóstico y pronóstico, pero no es particularmente adecuada para selección o para diagnósticos rápidos en el punto de atención. Por lo tanto, existe la necesidad por nuevas pruebas de diagnóstico para fallo cardíaco.

Una cantidad de estudios han demostrado la utilidad de la medición de los péptidos individuales derivados de la prohormona del péptido natriurético atrial (proANP) y la prohormona del péptido natriurético cerebral (proBNP) en el diagnóstico de insuficiencia cardíaca (Talwar et al 2000; De Lemos et al 2001; Daly et al 2002) . El fallo cardíaco está asociado con niveles circulantes elevados de péptido natriurético atrial (ANP) , péptido natriurético cerebral (BNP) , un fragmento del terminal N de proANP (NTproANP) y un fragmento del terminal N de proBNP (NT-proBNP) (Sagnella 1998) . Altas concentraciones en plasma están correlacionados con un pronóstico pobre después de infarto de miocardio e insuficiencia cardíaca (Omland et al 2002) . Además, el monitoreo de los niveles en plasma de NTproBNP parece ofrecer una orientación más poderosa en la terapia de insuficiencia cardíaca que el seguido por parámetros clínicos convencionales (Troughton et al 2000) .

Sin embargo los métodos de diagnóstico del estado del arte, tal como aquellos divulgados en WO 87/06938, WO 00/35951, WO 91/00292, US 5.786.163, EP 648 228 B1, WO 00/45176, WO 00/19207, US 6.124.430, EP 542 255 B1) o aquellos comercialmente disponibles, únicamente pretenden medir, y únicamente son capaces de medir, un solo péptido (ANP, BNP, NT-proANP o NT-proBNP) a la vez. Por ejemplo, el estado del arte divulga el uso del receptor del receptor del ANP o el receptor de NPRA (GC-A) en ensayos para determinar péptidos natriuréticos, pero no divulga ninguna determinación simultánea de péptidos natriuréticos. La patente de los Estados Unidos Número 5.747.274 divulga la detección simultánea de al menos tres marcadores cardíacos utilizando al menos tres pares diferentes de anticuerpos monoclonales o policlonales, cada uno específico para un marcador diferente. Por consiguiente, estos ensayos producen múltiples resultados. Por lo tanto, subsiste en el estado del arte la necesidad por un medio confiable y sensible pero relativamente económico y sencillo para detectar o diagnosticar fallo cardíaco tal como insuficiencia cardíaca.

US-A-6117644 describe un método para diagnosticar rechazo de un trasplante cardíaco en un paciente que comprende determinar el nivel de BNP o un fragmento del mismo en una muestra de fluido corporal del paciente.

Nishikimi et al (JACC 1995; 26: 1424 -31) describe la medición de los niveles en plasma de adrenomedulina en pacientes con insuficiencia cardíaca para investigar el papel de la adrenomedulina en la fisiopatología de la insuficiencia cardíaca.

Qi et al (American Heart Journal 2001; 142: 725 -732) describe un estudio que evalúa el BNP y el ANP circulante y la parte del terminal N de sus pro-péptidos como marcadores de hipotrofia ventricular izquierda y el incremento de presión atrial en pacientes con estenosis aórtica.

Ruskoaho (Endocrine Reviews 2003; 24 (3) : 341 -356) revisa hormonas cardiacas como herramientas de diagnóstico en insuficiencia cardíaca.

Por lo tanto la presente invención proporciona un método de análisis que detecta la activación o inactivación de los sistemas hormonales del ANP o del BNP mediante el análisis tanto para péptidos derivados de proANP como de proBNP en forma simultánea. Tanto los péptidos derivados de proANP como de proBNP pueden ser analizados en la misma muestra, al mismo tiempo. El método produce un solo resultado y se realiza de manera similar que los métodos del estado del arte. Además los presentes métodos de análisis muestran mayor sensibilidad que los métodos del estado del arte. Aún más, la presente prueba tiene una gran capacidad para producir un resultado confiable del análisis ya sea que el paciente esté en una fase temprana o en una fase tardía de insuficiencia cardíaca. La fórmula única del ensayo de la presente invención, llevada a cabo de por sí en forma simultánea, ofrece una alternativa más económica y rentable para los análisis disponibles permitiendo así una mediación confiable de activación o inactivación tanto de los sistemas hormonales del ANP y del BNP.

Resumen de la invención Por lo tanto la presente invención proporciona un método in vitro para determinar la activación o inactivación del sistema hormonal del péptido natriurético atrial (ANP) y del péptido natriurético cerebral (BNP) , comprendiendo el método detectar en forma simultánea en una sola lectura o resultado la presencia o la cantidad de prohormonas del péptido natriurético atrial y cerebral (proANP y proBNP) o fragmentos de las mismas en una muestra.

La invención también provee:

- un agente que comprende:

(a)

(i) proANP (SEQ ID NO. 1) , ANP (SEQ ID NO. 2) o NT-proANP (SEQ ID NO. 3) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y

(b)

(i) pro-BNP (SEQ ID NO. 4) , BNP. (SEQ ID NO. 5) , NT-proBNP (SEQ ID NO. 6) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; -un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica al agente, o secuencia complementaria: -un vector de expresión y una célula huésped que incluyen al polinucleótido; -un proceso para producir al agente polipeptídico que comprende:

(a) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido; y opcionalmente

(b) recuperar al polipéptido expresado; -un método para identificar una sustancia que se enlaza específicamente con

(a)

(i) proANP (SEQ ID NO. 1) , ANP (SEQ ID NO. 2) o NT-proANP (SEQ ID NO. 3) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud y

(b)

(i) pro-BNP (SEQ ID NO. 4) , BNP (SEQ ID NO. 5) , NT-proBNP (SEQ ID NO. 6) ;

(ii) una secuencia homóloga que... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para determinar la activación o inactivación del sistema hormonal del péptido natriurético atrial (ANP) y del péptido natriurético cerebral (BNP) , comprendiendo el método detectar en forma simultánea en una sola lectura o resultado la presencia o la cantidad de prohormonas del péptido natriurético atrial y cerebral (proANP y proBNP) o fragmentos de las mismas en una muestra, dicho método comprendiendo:

(I) poner en contacto la muestra con una primera sustancia de enlazamiento bi u oligo-específica que es capaz de enlazarse tanto con:

(a)

(i) proANP (SEQ ID NO: 1) , ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y

(b)

(i) pro-BNP (SEQ ID NO: 4) , BNP (SEQ ID NO: 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; o

(II) poner en contacto la muestra con -un agente que contiene:

(a)

(i) proANP (SEQ ID NO: 1) , ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y

(b)

(i) pro-BNP (SEQ ID NO: 4) , BNP (SEQ ID NO: 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y -una primera sustancia de enlazamiento que es capaz de enlazarse con:

(a)

(i) proANP (SEQ ID NO: 1) , ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y

(b)

(i) pro-BNP (SEQ ID NO: 4) , BNP (SEQ ID NO. 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y (c) el agente.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación1 (II) donde la primera sustancia de enlazamiento comprende:

(a) una sustancia de enlazamiento bi u oligo-específica; o

(b) una mezcla de sustancias de enlazamiento mono-específicas.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 donde la primera sustancia de enlazamiento comprende:

(a) receptor natriurético GC-A (SEQ ID NO: 33) ;

(b) secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (a) ; o

(c) un fragmento de (a) o (b) que tiene al menos 400 aminoácidos de longitud.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 donde la primera sustancia de enlazamiento comprende un dominio de enlazamiento extracelular del receptor natriurético GC-A (SEQ ID NO: 34) .

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 donde la primera sustancia de enlazamiento comprende un anticuerpo o un fragmento o derivado del mismo.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 donde el anticuerpo comprende un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo oligoclonal, un anticuerpo bifuncional o un anticuerpo policlonal de reacción cruzada.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 (II) o cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 que depende de la reivindicación 1 (II) donde en el agente, (a) (i) es la SEQ ID NO: 3 y (b) (i) es la SEQ ID NO: 6 o (a) (i) es la SEQ ID NO: 2 y (b) (i) es la SEQ ID NO: 5.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 (II) o cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 que depende de la reivindicación 1 (II) donde el agente comprende o consiste de:

(a) proBNP15-24 y proANP82-96;

(b) proBNP1-37 y proANP29-98;

(c) proBNP10-29 y proANP20-80;

(d) proBNP1-76 y proANP1-98;

(e) proBNP10-29 y proANP60-80;

(f) proBNP1-108 y proANP1-126;o

(g) proBNP77-92 y proANP112-126.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 (II) o cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8 que depende de la reivindicación 1 (II) donde el agente es un polipéptido.

10. A método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes donde la primera sustancia de enlazamiento y/o el agente están:

(a) marcados con una etiqueta detectable; y/o

(b) inmovilizados.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que adicionalmente comprende poner en contacto la muestra con una segunda sustancia de enlazamiento que es capaz de enlazarse con la primera sustancia de enlazamiento.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 donde la segunda sustancia de enlazamiento está:

(a) marcada con una etiqueta detectable; y/o

(b) inmovilizada.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 donde la segunda sustancia de enlazamiento provoca la precipitación de la primera sustancia de enlazamiento y de cualquier péptido que esté enlazado a ella.

14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende un inmunoensayo.

15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que permite diagnosticar insuficiencia cardíaca o monitorear el tratamiento de una condición cardíaca.

16. Un agente que es un polipéptido que comprende:

(a)

(i) proANP (SEQ ID NO: 1) , ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; y

(b)

(i) pro-BNP (SEQ ID NO: 4) , BNP (SEQ ID NO: 5) , NT-proBNP (SEQ ID NO: 6) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud.

17. Un agente de acuerdo con la reivindicación 16 que comprende o consiste de:

(a) proBNP15-24 y proANP82-96;

(b) proBNP1-37 y proANP29-98;

(c) proBNP10-29 y proANP20-80;

(d) proBNP1-76 y proANP1-98;

(e) proBNP10-29 y proANP60-80;

(f) proBNP1-108 y proANP1-126;o

(g) proBNP77-92 y proANP112-126.

18. Un agente de acuerdo con reivindicación 17 que comprende cualquiera de las SEQ ID Nos: 13, 14, 15, 17, 18, 19 ó 20.

19. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 que está marcado con una etiqueta detectable.

20. A polinucleótido que comprende la secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 o una secuencia que es complementaria a la secuencia de codificación.

21. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20 que comprende:

(a)

(i) las SEQ ID Nos 7, 8 ó 9;

(ii) una secuencia complementaria a (i) ;

(iii) una secuencia que hibrida bajo condiciones rigurosas a (i) o (ii) ;

(iv) una secuencia que se degenerada como resultado del código genético a (i) , (ii) o (iii) ;

(v) una secuencia que tiene al menos 70% de identidad con cualquiera de las secuencias en (i) hasta (iv) ; o

(vi) un fragmento hasta de 40 nucleótidos de longitud de cualquiera de las secuencias en (i) hasta (v) ; y

(b)

(i) las SEQ ID Nos 10, 11 ó 12;

(ii) una secuencia complementaria a (i) ;

(iii) una secuencia que hibrida bajo condiciones rigurosas a (i) o (ii) ;

(iv) una secuencia que se degenerada como resultado del código genético a (i) , (ii) o (iii) ;

(v) una secuencia que tiene al menos 70% de identidad con cualquiera de las secuencia en (i) hasta (iv) ; o

(vi) un fragmento hasta de 40 nucleótidos de longitud de cualquiera de las secuencias en (i) hasta (v) .

22. Un vector de expresión que contiene un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21.

23. Una célula huésped que comprende un polinucleótido de acuerdo con reivindicación 20 ó 21 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 22.

24. Un proceso para producir un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 cuyo proceso comprende:

(a) cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 23 bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido; y opcionalmente

(b) recuperar el polipéptido expresado.

25. Un proceso para producir un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 que comprende síntesis química.

26. Un anticuerpo bi u oligo-específico, fragmento o derivado del mismo que es capaz de enlazarse tanto con:

(a)

(i) proANP SEQ ID NO: 1) , ANP (SEQ ID NO: 2) o NT-proANP (SEQ ID NO: 3) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud; como con

(b)

(i) pro-BNP (SEQ ID NO: 4) , BNP (SEQ ID NO: 5) o NT-proBNP (SEQ ID NO: 6) ;

(ii) una secuencia homóloga que tiene al menos 70% de identidad con (i) ; o

(iii) un fragmento de (i) o (ii) que tiene al menos 6 aminoácidos de longitud.

27. Un anticuerpo, fragmento o derivado de acuerdo con la reivindicación 26 que está marcado con una etiqueta detectable.

28. Un proceso para elaborar un anticuerpo como se define en la reivindicación 26 ó 27 que comprende el cultivo de una célula que expresa al anticuerpo y opcionalmente purificar el anticuerpo de la célula.

29. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 28 en el cual la célula es una que puede ser obtenida por medio de la administración de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 a un mamífero, la extracción de células B del mamífero y seleccionar una célula de estas con base en la habilidad para expresar un anticuerpo con la especificidad del anticuerpo de la reivindicación 26.

30. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 28 en el cual la célula es recombinante para un polinucleótido que expresa al anticuerpo.

31. Un soporte sólido que comprende un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27 o un agente de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17.

32. Un soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 31, que es una partícula, barra, lámina o placa de microtitulación.

33. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21 o un anticuerpo, fragmento o derivado del mismo de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27 para uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal por medio del diagnóstico de insuficiencia cardíaca o el monitoreo del tratamiento de insuficiencia cardíaca.

34. El uso de una primera sustancia de enlazamiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21 o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27 para la fabricación de un reactivo para el diagnóstico de insuficiencia cardíaca y/o el monitoreo del tratamiento de insuficiencia cardíaca.

35. un kit de diagnóstico que comprende:

(a) una primera sustancia de enlazamiento como se define en la reivindicación 1 (I) ; o

(b) una primera sustancia de enlazamiento y un agente como se define en la reivindicación 1 (II) ;

donde opcionalmente la sustancia de enlazamiento y/o el agente está etiquetado.

36. Un kit de acuerdo con la reivindicación 35 donde la primera sustancia de enlazamiento es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, y/o está presente sobre un soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 31 ó 32.

37. Un kit de acuerdo con la reivindicación 35 ó 36 donde el agente es como se define en las reivindicaciones 16 a 19.

38. El uso de una primera sustancia de enlazamiento como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21, un anticuerpo, fragmento o derivado de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27, un soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 31 ó 32 o un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37 en un método in vitro para el diagnóstico de insuficiencia cardíaca y/o el monitoreo del tratamiento de insuficiencia cardíaca.

39. El uso de acuerdo con la reivindicación 38 que comprende un método como se define en cualquiera de las 20 reivindicaciones 1 a 15.