Método y dispositivo para la detección de carbohidratos.

Un método no enzimático para la determinación de la presencia o la cantidad de un analito carbohidratado en una muestra,

comprendiendo dicho método:

aplicar la muestra a un tejido sintético;

modificar químicamente dicho carbohidrato si está presente en la muestra con un agente oxidante con potencial de oxidación suficiente para escindir el carbohidrato entre dos grupos hidroxilo;

detectar la presencia o la cantidad de dicho carbohidrato modificado químicamente;

en donde la modificación química y la detección se llevan a cabo a la temperatura ambiente y en regiones separadas del tejido.

Método y dispositivo para la detección de carbohidratos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método, un dispositivo y un kit para el análisis de una muestra utilizando un tejido para determinar la presencia o la cantidad en la muestra de un analto, que es un carbohidrato, más particularmente un azúcar.

Antecedentes de la invención

La higiene ambiental recibe cada vez más atención en los laboratorios, las salas de espera de los médicos, en el hogar, en instalaciones públicas y en los centros de producción industriales. La tendencia es hacia el desarrollo de métodos con los que la persona que utiliza o limpia un espacio puede asegurar rápidamente su higiene. Tales métodos deben ser extremadamente simples, fáciles de utilizar, rápidos y baratos.

La higiene se puede asegurar mediante la determinación de la presencia de microbios, por ejemplo concentraciones de bacterias o sustancias que promueven el crecimiento de bacterias, en las superficies. El análisis de los microbios de las superficies con los métodos actuales es lento y requiere experiencia profesional. Un análisis de las sustancias - por ejemplo, azúcares y proteínas - que facilitan el crecimiento microbiano, por ejemplo, de bacterias u hongos, indica la limpieza de las superficies con una fiabilidad casi comparable.

Existen ensayos rápidos y sensibles para la determinación de la presencia de proteínas que se basan en la reacción de verde de bromocresol con proteínas. Tales ensayos se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente WO 26/122733, que comenta exhaustivamente los formatos de ensayo existentes basados en el uso de varias membranas. La solicitud también comenta ampliamente diversos métodos para aplicar reactivos a la membrana en forma de técnicas rodillo a rodillo u otras técnicas de impresión.

La mayoría de los métodos de análisis de carbohidratos conocidos tales como los azúcares se basan en métodos en los que los azúcares se indican por medio de un cambio de color. La mayoría de los métodos basados en el cambio de color se desarrollaron para el análisis espectrofotométrico de azúcares. Hasta la fecha, no se encuentran disponibles ensayos de bajo coste, rápidos y fáciles para determinar la presencia de azúcares sobre las superficies. Un problema relacionado con los azúcares es su estructura estable, lo que significa que su análisis requiere la presencia de enzimas específicas y probablemente inestables, la incubación a altas temperaturas elevadas, los tiempos de reacción prolongados y/o la utilización de productos químicos peligrosos para la salud o poco seguros.

Se encuentran disponibles varios métodos para el análisis de azúcares que se basan en el cambio de color. Los métodos basados en la reducción de cobre Incluyen análisis con reactivos de Fehling, arsenomolibdato y BCA (ácido bicinconínico). Otros métodos aplicables a la determinación de azúcares incluyen métodos con cianuro de hierro y DNS (ácido dinitrosalicílico), métodos basados en la formación de acétales, el método de la antrona, los métodos indicadores que incluyen grupos fenazlno, reactivos de Schlff y azul de tetrazolio, así como sensores borónicos basados en el dicroísmo circular, la fotoabsorclón y la fluorescencia. Otros métodos aplicables a la determinación de azúcares incluyen métodos enzlmátlcos tales como glucosa-oxldasa/peroxidasa y hexoqulnasa, y métodos de luminiscencia incluyendo biolumlnlscencla y qulmlolumlnlscencla.

Los métodos disponibles como tales no son aplicables para su uso en un formato de ensayo en el que se detectan azúcares utilizando el método del tejido. Todos los métodos basados en la reducción de cobre requieren calentamiento con el fin de efectuar la reacción con la suficiente rapidez.

En la Patente de los Estados Unidos 6.586.195, se utiliza Verde Janus B para indicar los azúcares. La patente demuestra que los azúcares reductores son capaces de reducir el Verde Janus B en concentraciones suficientemente altas, en el orden de 1 g/l, en condiciones alcalinas, en cuyo caso el Verde Janus B cambia de azul a gris. El cambio de color no es óptimo, ya que esta reacción - un cambio de azul a gris - hace que sea muy difícil determinar el resultado del ensayo con concentraciones cercanas al límite de detección.

Los métodos basados en la formación de acétales y el método de la antrona utilizan ácidos fuertes a una elevada concentración, lo que hace que estos métodos sean inadecuados en el desarrollo de un ensayo rápido basado en un tejido.

Los métodos indicadores implican una composición de reactivo sencilla, lo que reduce el volumen requerido de reactivos que se van a imprimir sobre el tejido. Con concentraciones suficientemente altas de azúcar, los cambios en el color indicador también se pueden observar incluso a la temperatura ambiente. El inconveniente es que sólo los azúcares con alto poder de reducción, p. ej. fructosa, pueden ser detectados. También hay una carencia de

indicadores disponibles en el mercado.

Los métodos enzimáticos y basados en la luminiscencia son sensibles y rápidos. Los inconvenientes asociados con algunas enzimas incluyen su coste y sus características inestables. Además, la acción especifica de las enzimas, es decir, que actúan únicamente sobre azúcares concretos, impide el uso de tales enzimas en ensayos rápidos, que deberían ser capaces de indicar un nivel total de todos o casi todos los carbohidratos. Los métodos basados en la luminiscencia son viables sólo en conexión con las enzimas modificadoras de azúcares y por lo tanto comparten los mismos problemas que los métodos enzimáticos.

Los métodos bien conocidos, familiares para los expertos en la materia y los reactivos que emplean no son aplicables como tales a los métodos de diagnóstico rápido. Por ejemplo, el método del cianuro de hierro no es adecuado para el análisis rápido de azúcares ya que en un entorno ácido el cianuro se libera en forma de cianuro de hidrógeno, una sustancia altamente tóxica. Algunos métodos pueden no funcionar a la temperatura ambiente (p. ej., el método DNS o el Verde Janus B), o pueden tener una escasa estabilidad (p. ej., los métodos que requieren enzimas, reactivo de Schiff y reactivos formadores de acétales). Varios métodos también requieren condiciones fuertemente ácidas o alcalinas.

Por consiguiente, existe la necesidad de un ensayo rápido y sensible para la determinación de carbohidratos en las superficies. Especialmente existe la necesidad de un ensayo que se pueda realizar sin un aumento de la temperatura.

Resumen de la invención

Un método no enzimático de determinación de la presencia o la cantidad de un analito carbohidratado en una muestra, comprendiendo dicho método:

aplicar la muestra a un tejido sintético;

modificar químicamente dicho carbohidrato, si está presente en la muestra, con un agente oxidante con potencial de oxidación suficiente para escindir el carbohidrato entre dos grupos hidroxilo; detectar la presencia o cantidad de dicho carbohidrato modificado químicamente;

en donde la modificación química y la detección se llevan a cabo a la temperatura ambiente y en regiones del tejido separadas.

[15 En una realización, los medios para modificar químicamente el analito, p. ej. el reactivo o los reactivos, están presentes en el tejido antes de aplicar la muestra al tejido. Preferiblemente, los reactivos se imprimen sobre o se colocan de otro modo, se absorben sobre o se adhieren al tejido.

En una realización de la presente invención, el método comprende adicionalmente la inactivación de un agente que interfiere en la detección del analito modificado químicamente. Preferiblemente, la modificación química y la inactivación del agente de interferencia se llevan a cabo antes de detectar el analito modificado químicamente. De acuerdo con esta realización, cualquier muestra o producto de interferencia, p. ej. agente, reactivo, composición o sustancia presente en la muestra, reactivo de análisis aplicado al tejido o formado durante el procedimiento de análisis puede ser sujeto de inactivación por ejemplo, por neutralización o mediante la prevención de su movimiento por medio de precipitación. En una realización, los medios para inactivar el agente de interferencia están presentes en el tejido antes de aplicar la muestra al tejido. Estos medios se imprimen preferiblemente sobre el tejido colocado de otro modo, adsorbido o adherido. En una realización tanto los medios para modificar químicamente el analito como los medios para inactivar el agente de interferencia están presentes sobre el tejido antes de aplicar la muestra al tejido.

La presente invención también... [Seguir leyendo]

1. Un método no enzimático para la determinación de la presencia o la cantidad de un analito carbohidratado en una muestra, comprendiendo dicho método:

aplicar la muestra a un tejido sintético;

modificar químicamente dicho carbohidrato si está presente en la muestra con un agente oxidante con potencial de oxidación suficiente para escindir el carbohidrato entre dos grupos hidroxilo; detectar la presencia o la cantidad de dicho carbohidrato modificado químicamente;

en donde la modificación química y la detección se llevan a cabo a la temperatura ambiente y en regiones separadas del tejido.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el carbohidrato comprende un azúcar, opcionalmente en donde el azúcar comprende fructosa, dextrina, lactosa, maltosa o sacarosa.

3. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente la inactivación de un agente que podría interferir en la detección de carbohidratos modificados químicamente, opcionalmente en donde la modificación química y la inactivación del agente de interferencia se llevan a cabo antes de la detección del carbohidrato modificado químicamente.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la inactivación del agente de interferencia se lleva a cabo en una región del tejido sintético que es posterior a aquella en la que tiene lugar la modificación química y a través de la cual pasa el carbohidrato modificado químicamente.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la modificación química es la reacción con un oxidante para abrir un enlace éter en un anillo de azúcar y/o para producir un grupo aldehido.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el agente modificador químico es ácido periódico o una sal peryodato.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde después de la reacción de modificación química y antes de la detección del carbohidrato modificado químicamente, se inactiva el exceso de oxidante que pueda interferir en la detección del carbohidrato modificado químicamente.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, 6 ó 7, en donde la detección del carbohidrato modificado químicamente es con un compuesto que contiene cobre para producir un cambio de color visible en presencia del carbohidrato modificado químicamente.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el tejido sintético es un tejido de poliéster.

1. Un método de acuerdo con la reivindicación 3 ó 7, en donde la muestra se desplaza a través del tejido sintético por la acción capilar y los medios para la modificación química, los medios para la inactivación del agente de interferencia y los medios de detección están en regiones sucesivas del tejido sintético a través de las cuales se desplaza la muestra, opcionalmente en donde el tejido sintético comprende peryodato de sodio o ácido peryódico como un agente oxidante para el azúcar, y en donde el método comprende neutralizar dicho peryodato de sodio o ácido periódico con tiosulfato de sodio o sulfato ferroso.

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra se aplica al tejido sintético mediante un método que comprende poner en contacto el tejido sintético con una superficie y limpiar la superficie o absorber la muestra de la superficie, opcionalmente en donde el tejido sintético o la superficie se ponen en contacto con una solución tampón antes de que el tejido sintético y la superficie se pongan en contacto uno con el otro.

12. Un dispositivo de ensayo que es adecuado para llevar a cabo el método no enzimático de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, cuyo dispositivo comprende un tejido sintético al que se puede aplicar la muestra, llevando el tejido sintético en regiones separadas un medio para modificar químicamente un carbohidrato a la temperatura ambiente con un agente oxidante con potencial de oxidación suficiente para escindir el carbohidrato entre dos grupos hidroxilo; y un medio para detectar a la temperatura ambiente el carbohidrato modificado químicamente; y, opcionalmente, un medio para inactivar un agente de interferencia.

13. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el tejido sintético se lamina con una capa impermeable y/o un material de la capa que permite el paso en una dirección de la muestra o el reactivo, opcionalmente

en donde la capa impermeable de laminación comprende al menos una apertura; o

en donde la capa laminada que permite el flujo en una dirección de la muestra o el reactivo limita el flujo de retorno de la muestra o el reactivo hacia la superficie con la muestra.

14. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, para la detección no enzimática de la presencia o la cantidad de un carbohidrato en una muestra, comprendiendo dicho dispositivo una capa de tejido sintético adaptada para el movimiento sucesivo de la muestra a través de la capa de tejido sintético, comprendiendo la capa de tejido sintético

un área de modificación química que comprende un medio para modificar químicamente el carbohidrato a la temperatura ambiente con un agente oxidante con un potencial de oxidación suficiente para escindir el carbohidrato entre dos grupos hidroxilo;

un área de inactivación que comprende un medio para inactivar un agente que interfiere en la detección del carbohidrato modificado químicamente; y

un área indicadora que comprende medios para detectar a la temperatura ambiente el carbohidrato modificado químicamente que comprende;

en donde el área de modificación química y el área de detección se encuentran en regiones separadas del tejido sintético.

15. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el área de inactivación está en una región del tejido sintético posterior al área de modificación química y adaptada para que el carbohidrato modificado químicamente pase a través de ella.

16. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicación 12, cuyo dispositivo comprende una capa de material de tejido sintético que comprende ácido peryódico o peryodato de sodio como reactivo para la modificación química del carbohidrato a la temperatura ambiente y comprende, adicionalmente, tiosulfato de sodio o sulfato ferroso para la neutralización de dicho reactivo de modificación química antes de detectar el carbohidrato modificado químicamente, siendo el carbohidrato modificado químicamente adecuado para la detección a la temperatura ambiente usando un agente complejante de cobre que utiliza ácido bicinconínico.

17. Un método de fabricación de un dispositivo de ensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, adecuado para llevar a cabo el método no enzimático de la reivindicación 1 y que comprende un tejido sintético al que se puede aplicar la muestra, comprendiendo el método de fabricación:

aplicar al material de tejido sintético mediante impresión un reactivo para modificar químicamente un carbohidrato a la temperatura ambiente con un agente oxidante con potencial de oxidación suficiente para escindir el carbohidrato entre dos grupos hidroxilo y un reactivo para detectar a la temperatura ambiente el carbohidrato modificado químicamente, en donde la impresión rodillo a rodillo se pone en contacto con el material de tejido sintético, mientras que el rodillo de contacto se hace girar y el rodillo de contacto y el material de tejido sintético se mueven relativamente y el reactivo para la modificación química de un carbohidrato y el reactivo de detección se aplican a regiones separadas del tejido sintético; y laminar el material de tejido sintético entre dos capas impermeables, teniendo una de las capas impermeables al menos una apertura alineada con el material de tejido sintético y a través del cual una muestra puede ser absorbida en el material de tejido sintético a partir de una superficie opcionalmente en donde dicha impresión rodillo a rodillo es la impresión por huecograbado.

18. Un kit para la determinación no enzimática de la presencia o la cantidad de un carbohidrato en una muestra, comprendiendo dicho kit un dispositivo de ensayo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, para llevar a cabo el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11;

y que comprende adicionalmente una solución tampón para humedecer el material de tejido sintético o una superficie de la que se va a tomar la muestra para crear dicha muestra.

19. El uso de un método como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para detectar la presencia de un carbohidrato sobre una superficie para indicar la contaminación de la superficie, en particular la contaminación con una sustancia que facilita el crecimiento microbiano.