Ensayo de la actividad NS2/3 del virus de la hepatitis C.

Un método para la detección de la actividad de autoescisión de NS2/3 en una muestra que contiene la proteasaNS2/3 sin la necesidad de una separación física entre la proteasa NS3 y la proteasa NS2/3,

y el método incluye lospasos de:

a) someter la muestra a unas condiciones bajo las cuales al menos una porción de la proteasa NS2/3 seautoescinde para producir un producto de la proteasa NS3;

b) incubar la muestra que contiene el producto de la proteasa NS3 generado en el paso a) con una cantidadadecuada de un cofactor NS4A en presencia de un detergente que es óxido de laurildietilamina (LDAO) o ndodecil-ß-D-maltósido (DM) y un sustrato de NS3 apropiado, bajo unas condiciones suficientes para permitirque el producto de la proteasa NS3 catalice la escisión del sustrato de NS3 para producir un subproducto delsustrato NS3; y

c) detectar el subproducto del sustrato de NS3 generado en el paso b), donde la detección del subproductodel sustrato de NS3 indica la actividad de autoescisión de NS2/3 en una muestra.

Ensayo de la actividad NS2/3 del virus de la hepatitis C.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia a un ensayo para la detección de la escisión de la proteína del VHC en una muestra, y más particularmente, a un ensayo para la detección selectiva de la actividad de autoescisión de la NS2/3 del VHC, y aún más particularmente para la identificación de compuestos inhibitorios potenciales del VHC.

Antecedentes de la invención

El virus de la hepatitis C (VHC) es el principal agente etiológico de hepatitis no-A, no-B postransfusional y adquirida en la comunidad a nivel mundial. Un porcentaje de portadores se convierten en infectados crónicos y muchos de ellos progresan hacia enfermedad hepática crónica, la llamada hepatitis C crónica. Este grupo, a su vez, presenta un alto riesgo de padecer una enfermedad hepática grave, tal como la cirrosis hepática, el carcinoma hepatocelular y la enfermedad hepática terminal, los cuales llevan a la muerte.

El VHC es una virus RNA de cadena positiva y cubierto de la familia Flaviviridae. El genoma RNA de cadena simple del VHC tiene una polaridad positiva y contiene un marco de lectura abierto (ORF) de aproximadamente 9.600 nucleótidos de longitud que codifica por una poliproteína lineal de aproximadamente 3.010 aminoácidos. En las células infectadas, esta proteína se escinde en múltiples lugares mediante proteasas celulares y virales para producir unas proteínas estructurales y no estructurales (NS) . Las proteínas estructurales (C, E1, E2 y p7) contienen polipéptidos que constituyen la partícula viral. El procesamiento de las proteínas estructurales se cataliza mediante las proteasas de la célula huésped. Las proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) codifican por enzimas o factores accesorios que catalizan y regulan la replicación del genoma RNA del VHC. La generación de proteínas no estructurales maduras se cataliza mediante dos proteasas codificadas por el virus. La primera es la proteasa NS2/3, la cual autocataliza la escisión entre NS2 y NS3. La NS3 contiene un dominio serín proteasa Nterminal y cataliza las escisiones restantes de la poliproteína. La proteína NS4A producida tiene, al menos, dos roles. El primer rol consiste en la formación de un complejo estable junto a la proteína NS3 y la colaboración en la localización en la membrana del complejo NS3/NS4A; el segundo consiste en la actuación como cofactor para la actividad proteasa NS3. A su vez, este complejo asociado a la membrana cataliza la escisión de los lugares restantes de la poliproteína, efectuando así la liberación de NS4B, NS5A y NS5B.

La escisión de la poliproteína del virus de la hepatitis C (VHC) entre las proteínas no estructurales NS2 y NS3 está mediada por la proteasa NS2/3, una actividad proteasa que está codificada por la región NS2 y el dominio proteasa NS3 mínimo que flanquea el lugar de la escisión. La proteasa NS2/3 se expresa en los hepatocitos infectados por el virus y los datos experimentales coinciden en su rol esencial para la propagación del virus y de la enfermedad. De hecho, no se observó una infección productiva en chimpancés en los que se había inoculado clones del VHC que contenían mutaciones que abolían la actividad proteasa NS2/3, sugiriendo que esta enzima codificada por el VHC es esencial para la replicación productiva in vivo (1) .

Se ha definido una región catalítica mínima de la proteasa NS2/3 y ésta incluye el extremo C-terminal de NS2 y el extremo N-terminal del dominio proteasa NS3 (2-5) . La variante NS2/3 (904-1206) del genotipo del VHC 1b se purificó a partir de los cuerpos de inclusión de E. coli y se replegó mediante cromatografía de filtración en gel tal y como se describe previamente (2, 3) . La forma inactiva y purificada de NS2/3 (904-1206) puede activarse mediante la adición de glicerol y detergente para inducir la autoescisión en el lugar predicho entre el residuo de leucina 1026 y el residuo de alanina 1027 (2, 3) . In vitro, la forma aislada de la proteína NS2/3 posee ambas actividades proteasa, es decir, la actividad de autoescisión de la proteasa NS2/3 y la actividad proteasa NS3. Se requiere la separación de los productos resultantes de la escisión del precursor NS2/3, o al menos la discriminación entre las dos formas de actividad proteasa NS3, para evaluar la cantidad de proteasa NS3 producida mediante la autoescisión de NS2/3 en la misma mezcla de reacción.

Se han descrito ensayos de detección de la escisión de la proteasa NS2/3 basados en la separación de los productos NS2 y NS3 procedentes del precursor NS2/3 mediante SDS-PAGE y mediante HPLC, así como un ensayo basado en la actividad proteasa NS3 de la proteína NS2/3, que también requiere la separación de precursores NS2/3 no escindidos del producto de la proteasa NS3 (2-5) . Tales métodos pueden llevar mucho tiempo y no están adaptados al cribaje rápido. Además, aún no se ha desarrollado ningún ensayo que presente selectividad para la detección de los productos de escisión de NS2/3 en presencia de la NS2/3 no escindida.

Entonces sería deseable desarrollar un ensayo de escisión de la NS2/3 eficiente que salve una o más de las desventajas de los ensayos existentes. Particularmente, es deseable desarrollar un ensayo de escisión NS2/3 eficiente que discrimine entre las actividades proteasa NS3 de la proteína NS2/3 y los productos de escisión de la proteasa NS3.

Se proporciona un nuevo método de ensayo NS3-selectivo que incluye la escisión de la proteasa NS2/3 en una muestra y el tratamiento de la muestra escindida, lo cual permite la detección del producto de escisión NS3 en ella. El método es útil para detectar el producto de escisión de NS3 sin tener que separar el precursor NS2/3 del mismo.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un nuevo ensayo para la detección de la escisión de NS2/3. Más particularmente, la presente invención proporciona un nuevo ensayo para la detección del producto de escisión de NS3 en presencia de NS2/3 no escindida basado en la discriminación de la actividad del producto resultante de la proteasa NS3 respecto a la actividad proteasa NS3 de la proteína NS2/3 no escindida.

Hemos observado que ciertas condiciones de reacción permiten la discriminación in situ sin tener que to recurrir a la separación física de ambas proteasas. Estas condiciones permiten esta discriminación mediante la disminución de la actividad de la proteasa NS3 de la proteína NS2/3 y el aumento de la actividad proteasa NS3 del producto resultante de la proteasa NS3, produciendo así una "ventana de señal" sobre la cual es factible la distinción y medición de la actividad proteasa NS3 producida a partir de la escisión de NS2/3.

En la presente invención, tras la autoescisión de NS2/3 para generar un producto de NS3, la muestra se incuba con un sustrato de NS3 en presencia de una cantidad suficiente de cofactor NS4A y un detergente adecuado. Tales condiciones adecuadas producirán un efecto discriminatorio entre ambas formas de la proteasa.

Consecuentemente, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para la detección de la actividad de autoescisión de NS2/3 en una muestra que contiene la proteasa NS2/3 sin que haya una separación física entre la proteasa NS3 y la proteasa NS2/3, y el método incluye los pasos de:

a) someter la muestra a unas condiciones bajo las cuales al menos una porción de la proteasa NS2/3 se autoescinde para producir un producto de la proteasa NS3;

b) incubar la muestra que contiene el producto de la proteasa NS3 generado en el paso a) con una cantidad adecuada de un cofactor NS4A en presencia de un detergente adecuado y un sustrato de NS3 apropiado bajo las condiciones suficientes para permitir que el producto de la proteasa NS3 catalice la escisión del sustrato de NS3 para producir un subproducto del sustrato NS3; y

c) detectar el subproducto del sustrato de NS3 generado en el paso b) , donde la detección del subproducto del sustrato de NS3 indica la actividad de autoescisión de NS2/3 en una muestra.

Tal y como los expertos en la materia entenderán, la detección del subproducto del sustrato de NS3 puede medirse para producir una cantidad específica que se correlacione con la cantidad de la autoescisión de NS2/3.

La presente invención también es útil para cribar compuestos inhibitorios de NS2/3 candidatos que pueden ser útiles en... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección de la actividad de autoescisión de NS2/3 en una muestra que contiene la proteasa NS2/3 sin la necesidad de una separación física entre la proteasa NS3 y la proteasa NS2/3, y el método incluye los pasos de:

a) someter la muestra a unas condiciones bajo las cuales al menos una porción de la proteasa NS2/3 se autoescinde para producir un producto de la proteasa NS3;

b) incubar la muestra que contiene el producto de la proteasa NS3 generado en el paso a) con una cantidad adecuada de un cofactor NS4A en presencia de un detergente que es óxido de laurildietilamina (LDAO) o ndodecil--D-maltósido (DM) y un sustrato de NS3 apropiado, bajo unas condiciones suficientes para permitir que el producto de la proteasa NS3 catalice la escisión del sustrato de NS3 para producir un subproducto del sustrato NS3; y

c) detectar el subproducto del sustrato de NS3 generado en el paso b) , donde la detección del subproducto del sustrato de NS3 indica la actividad de autoescisión de NS2/3 en una muestra.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde se utiliza LDAO a una concentración de entre el 0, 2% y el 2%

o donde se utiliza DM a una concentración de entre el 0, 05% y el 2%.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicha proteasa NS2/3 incluye una proteasa NS2/3 que se corresponde con la Id. de Sec. Nº 1 (aminoácidos entre 810 y 1206 de GenBank, número de acceso AAB67036) .

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicha proteasa NS2/3 incluye un fragmento que se corresponde con la Id. de Sec. Nº 2.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicha proteasa NS2/3 incluye un fragmento que se corresponde con la Id. de Sec. Nº 3.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 3, donde dicha proteasa NS2/3 además incluye un marcador de afinidad o un marcador detectable.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, donde dicha proteasa NS2/3 es tal y como se define en la Id. de Sec. Nº 4.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho cofactor NS4A consiste esencialmente en un péptido que tiene la secuencia GSWIVGRIILSGR tal y como se define en la Id. de Sec. Nº 8.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicho cofactor NS4A presenta la secuencia KKGSVVIVGRIILSGRK tal y como se define en la Id. de Sec. Nº 9.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 8, donde dicho cofactor NS4A se utiliza a un exceso molar de unas 1000 veces en relación con el producto de la proteasa NS3.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho sustrato de NS3 está basado en una secuencia consenso que incluye la secuencia (D o E) X) CXXC (A o S) donde X es cualquier aminoácido.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicho sustrato de NS3 incluye un depsipéptido seleccionado de un grupo que consiste en: DEMEEC-ASH [Id. de Sec. Nº 6] y DDIVCC-SMSYTW [Id. de Sec. Nº 7].

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicho sustrato de NS3 consiste esencialmente en: Ac-DED (EDANS) EE-Abu-[C (O) -O]ASK (DABCIL) -NH2 tal y como se define en la Id. de Sec. Nº 10.

14. Un ensayo para el cribaje de un compuesto candidato para la actividad inhibitoria de la autoescisión de NS2/3 en una muestra que contiene la proteasa NS2/3, y el ensayo incluye:

a) someter una primera muestra que contiene la proteasa NS2/3 a unas condiciones bajo las cuales al menos una porción de la proteasa NS2/3 se autoescinde para producir un producto de la proteasa NS3;

b) someter una segunda muestra que contiene la proteasa NS2/3, en presencia de un compuesto candidato, a las mismas condiciones que en el paso a) ;

c) incubar cada una de las muestras primera y segunda con una cantidad suficiente de un cofactor NS4A en presencia de en presencia de un detergente que es óxido de laurildietilamina (LDAO) o n-dodecil--Dmaltósido (DM) y un sustrato de NS3 apropiado durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que el producto de la proteasa NS3 catalice la escisión del sustrato de NS3, para producir consecuentemente un subproducto del sustrato NS3;

d) determinar la cantidad del subproducto del sustrato de NS3 generado en cada una de las muestras primera y segunda, donde la disminución en la cantidad del subproducto del sustrato NS3 generado en la segunda muestra en comparación con la cantidad de subproducto del sustrato NS3 generado en la primera muestra indica que el compuesto candidato puede ser un inhibidor de la actividad de autoescisión de NS2/3.

15. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 14, donde se utiliza LDAO a una concentración de entre el 0, 2% y el 2% o donde se utiliza DM a una concentración de entre el 0, 05% y el 2%.

16. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicha proteasa NS2/3 incluye una proteasa NS2/3 que corresponde con la Id. de Sec. Nº 1 (aminoácidos entre 810 y 1206 de GenBank, número de acceso AAB67036) .

17. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicha proteasa NS2/3 incluye un fragmento que se corresponde con la Id. de Sec. Nº2.

18. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicha proteasa NS2/3 incluye un fragmento que se corresponde con la Id. de Sec. Nº3.

19. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 16, donde dicha proteasa NS2/3 incluye además un marcador de afinidad o un marcador detectable.

20. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 19, donde dicha proteasa NS2/3 es tal y como se define en la Id. de Sec. Nº 4.

21. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicho cofactor NS4A consiste esencialmente en un péptido que tiene la secuencia GSWIVGRIILSGR tal y como se define en la Id. de Sec. Nº 8.

22. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 21, donde dicho cofactor NS4A tiene la secuencia KKGSVVIVGRIILSGRK tal y como se define en la Id. de Sec. Nº 9.

23. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 21, donde dicho cofactor NS4A se utiliza a un exceso molar de unas 1000 veces en relación con el producto de la proteasa NS3.

24. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicho sustrato de NS3 está basado en una secuencia consenso que incluye la secuencia (D o E) X) CXXC (A o S) donde X es cualquier aminoácido.

25. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 24, donde dicho sustrato de NS3 incluye un depsipéptido seleccionado de un grupo que consiste en: DEMEEC-ASH [Id. de Sec. Nº 6] y DDIVCC-SMSYTW [Id. de Sec. Nº 7].

26. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 24, donde dicho sustrato de NS3 consiste esencialmente en: Ac-DED (EDANS) EE-Abu-[C (O) -O]ASK (DABCIL) -NH2 tal y como se define en la Id. de Sec. Nº 10.