Inmunoensayo para la detección de factor de crecimiento tipo insulina pegilado que comprende un anticuerpo de captación y un anticuerpo trazador,

caracterizado porque

a) dicho anticuerpo de captación es un anticuerpo anti-polietilenglicol monoclonal,

b) dicho factor de crecimiento tipo insulina pegilado es detectado como complejo con una proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado,

c) dicho anticuerpo trazador es un anticuerpo anti-digoxigenina monoclonal, en el que la incubación de dicho factor de crecimiento tipo insulina pegilado y dicha proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado se extiende a 12-24 horas a temperatura ambiente con una concentración de dicha proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado de 5,0 µg/ml, o menos.

Ensayo de factor de crecimiento tipo insulina pegilado.

Descripción La presente invención pertenece al campo de los inmunoensayos, de modo más preciso se refiere a un inmunoensayo para la detección y cuantificación de factor de crecimiento tipo insulina pegilado por la formación y la determinación de un complejo de factor de crecimiento tipo insulina pegilado y a una proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina.

Antecedentes de la invención

Los factores de crecimiento tipo insulina I y II (IGF I y IGF II) son miembros de la superfamilia de las hormonas de la insulina, factores de crecimiento y neuropéptidos, cuyas acciones biológicas se consiguen por la unión a receptores de la superficie de la célula, por ejemplo, el receptor I del factor de crecimiento tipo insulina o el receptor II del factor de crecimiento tipo insulina. El eje del factor de crecimiento tipo insulina y la hormona de crecimiento (GH) juegan un importante papel en la regulación del crecimiento somático y fetal de la infancia. Varias décadas de investigación básica y clínica han demostrado que también es crítico para el mantenimiento del crecimiento neoplásico (Khandwala, H.M., y otros, Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244) . Las acciones del factor de crecimiento tipo insulina son reguladas por proteínas de unión al factor de crecimiento tipo insulina (IGFBP) , que actúan como transportadoras de factores de crecimiento tipo insulina, protegiéndolos contra la degradación, limitando o inhibiendo su unión a receptores y manteniendo una “reserva” de factor de crecimiento tipo insulina biológicamente inactiva (Martin, J.L., y Baxter, R.C., proteínas de unión a IGF como moduladores de las acciones de IGF, en Rosenfeld, R.G., y Roberts, CT. (eds.) , The IGF system, Molecular Biology, Physiology, and Clinical Applications (1999) , Humana Press, Totowa, 227-255; Jones, J.L., y Clemmons, D.R., Endocr. Rev. 12 (1995) 10-21; Khandwala, H.M., y otros, Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244; Hwa, V., y otros, The IGF binding protein superfamily, en Rosenfeld, R.G., y Roberts, CT. (eds.) , The IGF system, Molecular Biology, Physiology, and Clinical Applications (1999) , Humana Press, Totowa, pp. 315327) . Prácticamente, cada nivel de respuesta en tejidos tumorales mediadas por el sistema del factor de crecimiento tipo insulina (receptores IGF, IGFBP, IGF) puede ser objetivo de enfoques terapéuticos (Khandwala, H.M., y otros, Endocr. Rev. 21 (2000) 215-244; Fanayan, S., y otros, J. Biol. Chem. 275 (2000) 39146-39151; Imai, Y., y otros, J. Biol. Chem. 275 (2000) 18188-18194) . También se debe mencionar que la proteína 3 de unión al factor de crecimiento tipo insulina tiene efectos anti-proliferativos y pro-apoptóticos independientes del factor de crecimiento tipo insulina (Wetterau, L.A., y otros, MoI. Gen. Metab. 68 (1999) 161-181; Butt, A.J., y otros, J. Biol. Chem. 275 (2000) 39174-39181) . El factor de crecimiento tipo insulina I es una hormona circulante relacionada estructuralmente a la insulina. El factor de crecimiento tipo insulina I es considerado tradicionalmente el mediador principal de las acciones de la hormona de crecimiento sobre tejidos periféricos. El factor de crecimiento tipo insulina I consiste en 70 aminoácidos y se llama también Somatomedin C y está definido por SwissProt No. PO 1343. Su utilización, actividad y producción son mencionadas, por ejemplo, por Ie Bouc, Y., y otros, FEBS Lett. 196 (1986) 108-1 12; de Pagter-Holthuizen, P., y otros, FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberg Nordqvist, A.C., y otros, Brain Res. MoI. Brain Res. 12 (1992) 275-277; Steenbergh, P.H., y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 175 (1991) 507-514; Tanner, J.M., y otros, Acta Endocrinol. (Copenhagen) 84 (1977) 681-696; Uthne, K., y otros, J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554; EP 0 123 228; EP 0 128 733; US 5.861.373; US 5.714.460; EP 0 597 033; WO 02/32449; WO 93/02695.

La regulación de la función del factor de crecimiento tipo insulina I es muy compleja. En la circulación, solamente existe un nivel marginal de 0, 2% a 1, 0% de factor I de crecimiento tipo insulina en forma libre, mientras que la mayoría está unida a proteínas de unión al factor de crecimiento tipo insulina, que tiene afinidades muy grandes con los factores de crecimiento tipo insulina y modulan la función del factor de crecimiento I tipo a la insulina. El factor puede ser liberado localmente por los mecanismos que liberan el factor I de crecimiento tipo insulina, tal como proteólisis de proteínas de unión al factor de crecimiento tipo insulina por proteasas.

El factor I de crecimiento tipo insulina juega un papel paracrino en el cerebro en desarrollo y madurez (Werther, G.A., y otros, MoI. Endocrinol. 4 (1990) 773-778) . Estudios in vitro indican que el factor I de crecimiento tipo insulina es un potente agente trópico no selectivo para varios tipos de neuronas en el CNS (Knusel, B., y otros, J. Neurosci. 10 (1990) 558-570; Svrzic, D., y Schubert, D., Biochem. Biophys. Res. Commun. 172 (1990) 54-60) , incluyendo las neuronas dopaminérgicas (Knusel, B., y otros, J. Neurosci. 10 (1990) 558-570) y oligodendrocitos (McMorris, F. A., y Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209; McMorris, F. A., y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826; Mozell, R.L., y McMorris, F.A., J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390) ) . El documento US US

5.093.317 menciona que la supervivencia de células neuronales colinérgicas es reforzada por la administración del factor II de crecimiento tipo insulina. Se sabe además que el factor I de crecimiento tipo insulina estimula la regeneración de nervios periféricos (Kanje, M., y otros, Brain Res. 486 (1989) 396-398) y mejora la actividad de la ornitina descarboxilasa (US 5.093.317) . Los documentos US 5.861.373 y WO 93/02695 mencionan un método de tratamiento de lesiones o enfermedades del sistema nervioso central que afectan predominantemente a células glía y/o células neuronales no colinérgicas al incrementar la concentración o concentraciones activas de factor I de crecimiento tipo insulina y/o análogos del mismo, en el sistema nervioso central del paciente. El documento WO 02/32449 está dirigido a métodos para reducir o prevenir el daño isquémico en el sistema nervioso central de un mamífero, por administración, a la cavidad nasal del mamífero, de un compuesto farmacéutico que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de factor I de crecimiento tipo insulina o variantes biológicamente activas del mismo. El factor I de crecimiento tipo insulina es absorbido a través de la cavidad nasal y transportado al sistema nervioso central del mamífero en una cantidad efectiva para reducir o impedir daños isquémicos asociados con un evento isquémico. En el documento EP 0 874 641 se da a conocer la utilización de un factor I de crecimiento tipo insulina o un factor II de crecimiento tipo insulina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de daños neuronales en el sistema nervioso central.

La reducción de niveles en el cerebro y en el suero de factor libre I de crecimiento tipo insulina han sido relacionados con la patogénesis de formas esporádicas y familiares de la enfermedad de Alzheimer. Por otra parte, el factor I de crecimiento tipo insulina protege las neuronas contra la neurotoxicidad inducida por A1 (Niikura, T., y otros, J. Neurosci. 21 (2001) 1902-1910; Dore, S., y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4772-4777; Dore, S., y otros, Ann. NY Acad. Sci. 890 (1999) 356-364) . Recientemente, se ha demostrado que el factor II de crecimiento tipo insulina administrado periféricamente es capaz de reducir los niveles de A1 en el cerebro en ratas y ratones (Carro, E., y otros, Nat. Med. 8 (2002) 1390-1397) . Además, el estudio ha demostrado que en el tratamiento prolongado con factor I de crecimiento tipo insulina del modelo de un ratón transgénico AD reducía significativamente la carga de placas amiloides en el cerebro. Estos datos apoyan firmemente la idea de que el factor I de crecimiento tipo insulina es capaz de reducir los niveles de A1 en el cerebro y demencia del cerebro asociada a placas al eliminar A1 del cerebro.

El factor I de crecimiento tipo insulina y el factor II de crecimiento tipo insulina son polipéptidos de cadena única, idénticos al 67%, de 70 y 67 aminoácidos, respectivamente, que comparten con la insulina, aproximadamente, el 40% de identidad de secuencia y de supuesta homología estructural. Los primeros 29 residuos de los factores de crecimiento tipo insulina son homólogos en la cadena B de insulina (región B, 1-29) , seguido por 12 residuos que son análogos al péptido C de proinsulina (región C, 30-41) , y una región de 21 residuos... [Seguir leyendo]

1. Inmunoensayo para la detección de factor de crecimiento tipo insulina pegilado que comprende un anticuerpo de captación y un anticuerpo trazador, caracterizado porque a) dicho anticuerpo de captación es un anticuerpo anti-polietilenglicol monoclonal, b) dicho factor de crecimiento tipo insulina pegilado es detectado como complejo con una proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado, c) dicho anticuerpo trazador es un anticuerpo anti-digoxigenina monoclonal, en el que la incubación de dicho factor de crecimiento tipo insulina pegilado y dicha proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado se extiende a 12-24 horas a temperatura ambiente con una concentración de dicha proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado de 5, 0 !g/ml, o menos.

2. Inmunoensayo, según la reivindicación 1, caracterizado porque a) dicho anticuerpo anti-polietilenglicol es conjugado a una fase sólida, y b) dicho anticuerpo anti-digoxigenina es conjugado a un marcador detectable.

3. Inmunoensayo, según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho marcador detectable es seleccionado a partir de enzimas, antígenos, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes, grupos electroquimioluminiscentes, y complejos metal-quelato.

4. Inmunoensayo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el factor de crecimiento tipo insulina pegilado es un factor I de crecimiento de tipo insulina pegilado o una variante pegilado del mismo.

5. Inmunoensayo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicha proteína de unión a factor de crecimiento tipo insulina es la proteína 4 de unión a factor de crecimiento tipo insulina.

6. Inmunoensayo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la incubación de dicho factor de crecimiento tipo insulina pegilado y dicha proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado es de 18 a 22 horas.

7. Inmunoensayo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la etapa de incubación de dicho factor de crecimiento tipo insulina pegilado y dicha proteína de unión a factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado tiene lugar con una concentración de dicha proteína de unión a factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado de 0, 1 !g/ml a 5, 0 !g/ml.

8. Método, para la determinación del factor de crecimiento tipo insulina pegilado en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

a) disponer una muestra a analizar, b) incubar un anticuerpo anti-polietilenglicol conjugado a dicha fase sólida con dicha muestra para formar un complejo de anticuerpo anti-polietilenglicol/factor de crecimiento tipo insulina pegilado, c) incubar dicho complejo formado en b) con proteína 4 de unión a factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado para formar un complejo que comprende el complejo formado en b) a temperatura ambiente durante 12 a 24 horas con una concentración de dicha proteína 4 de unión a factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado de 5, 0 !g/ml, o menos, d) incubar dicho complejo formado en c) con un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con peroxidasa de rábano para formar un complejo que comprende el complejo formado en c) , e) determinar el factor de crecimiento tipo insulina pegilado por incubación del complejo formado en d) con ABTS y a partir de la formación de un producto dotado de color.

9. Método, según la reivindicación 8, caracterizado porque después de las etapas b) , c) , y/o d) se lleva a cabo una etapa de lavado.

10. Método, según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque dicho factor de crecimiento tipo insulina pegilado es el factor I de crecimiento tipo insulina pegilado o una variante pegilado del mismo.

11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque la incubación de dicho factor de crecimiento tipo insulina pegilado y dicha proteína 4 de unión a factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado es de 18 a 22 horas.

12. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque la incubación de dicho factor de crecimiento tipo insulina pegilado y dicha proteína 4 de unión a factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado tiene lugar con una concentración de dicha proteína 4 de unión a factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado de 0, 1 !g/ml a 5, 0 !g/ml.

13. Utilización de un método, según la reivindicación 8, para el seguimiento de un paciente al que se le administra factor I de crecimiento tipo insulina pegilado o una variante pegilado del mismo.

14. Método para la determinación cuantitativa de la cantidad de factor de crecimiento tipo insulina pegilado en una muestra, que comprende las siguientes etapas:

a) disponer una muestra a analizar, b) disponer una muestra de referencia que contiene una cantidad definida de un factor de crecimiento tipo insulina pegilado, c) incubar un anticuerpo anti-polietilenglicol conjugado a una fase sólida cada una de dichas muestras y, como mínimo, dos muestras de referencia que contienen diferentes cantidades de factor de crecimiento tipo insulina pegilado, para formar un complejo de anticuerpo anti-polietilenglicol/factor de crecimiento tipo insulina pegilado, d) incubar dicho complejo formado en c) en cada una de las muestras y muestras de referencia con proteína 4 de unión a factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado, para formar un segundo complejo que comprende el complejo formado en c) , de manera que la incubación con proteína 4 de unión a factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado tiene lugar durante 12 a 24 horas a temperatura ambiente, con una concentración de dicha proteína 4 de unión a factor de crecimiento tipo insulina digoxigenilado de 5, 0 !g/ml, o menos, e) incubación de dicho complejo formado en d) en cada una de las muestras y muestras de referencia con un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado de peroxidasa de rábano, para formar un tercer complejo que comprende el complejo formado en d) , f) incubar el complejo formado en e) en cada una de las muestras y muestras de referencia con ABTS durante un tiempo de 5 a 15 minutos y determinar la cantidad del producto dotado de color que se ha formado, g) determinar cuantitativamente la cantidad de factor de crecimiento tipo insulina pegilado en dicha muestra, basado en una curva de calibrado calculada en base a la cantidad del producto de color formado en las muestras de referencia.

15. Método, según la reivindicación 14, caracterizado porque en la etapa d) dicha incubación tiene lugar durante 18 a 22 horas.