Un ensamblaje de lípidos que comprende un lípido catiónico que comprende un resto guanido y unlípido aniónico que comprende un grupo carboxilo,

caracterizado además porque la relación entre el resto guanidodel lípido catiónico y el grupo carboxilo del lípido aniónico es menor o igual a 1,5.

Emulación de estructuras de lipoproteínas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a liposomas que superan un bloqueo de la captación mediada por lipoproteína. Más específicamente, la invención se refiere a mejoras en o relacionadas con liposomas en los que una parte de sus grupos principales lípidos polares comprenden restos guanido o sus derivados.

Antecedentes de la invención

Los liposomas tienen un amplio uso como vehículos para ingredientes activos. Los liposomas neutros

o cargados negativamente son demandados a menudo para la administración de pequeñas moléculas de fármacos, mientras que los cargados positivamente (catiónicos) o el tipo de liposomas anfóteros recientemente introducido se usan principalmente para la administración de ácidos nucleicos a plásmidos u oligonucleótidos. Entre los ejemplos importantes de liposomas catiónicos usados para la administración de cargas de ácidos nucleicos se incluyen, pero no se limitan a Akinc y col., nat biotech (2008) 26 : 561 -569; Chien y col., Cancer Gene Ther (2005) 12 : 321 -328; de Fougerolles, Nat Rev Drug Discov (2007) 6 : 443 -453; Kim y col., Mol Ther (2006) 14 : 343 -350; Morrissey, nat biotech (2005) 23 : 1002 -1007; Peer, Science (2008) 319 : 627 -630 o Santel, Gene Ther (2006) 13 : 1222 -1234.

El Documento WO 02/066012 da a conocer el concepto general de los liposomas anfóteros que tienen una fase estable a pH tanto bajos como neutros. El documento WO 02/066012 y también el documento WO 07/107304 describen un procedimiento para introducir en dichas partículas ácidos nucleico partiendo de un pH bajo. Se ha demostrado la aplicación de estos liposomas para la administración de ácidos nucleicos en Andreakos, Arthritis Rheum (2009) 60 : 994 -1005. Además, el documento WO 08/043575 desvela estrategias para la optimización de la estabilidad, la fusogenicidad y la transfección celular de liposomas anfóteros.

Los liposomas anfóteros de acuerdo con las referencias anteriormente mencionadas son potentes transfectantes de células. Se ha observado sin embargo, que la función de algunos de estos liposomas podría bloquearse mediante la adición de algunos sueros, limitando por tanto potencialmente la actividad de estos liposomas para la dirección de algunas células in vivo. Esto se ilustra adicionalmente en el ejemplo 3.

Una investigación más detallada desveló que las proteínas eran mediadoras de este efecto inhibidor. Tal como se muestra en el ejemplo 4, un suero humano que es deficiente en lipoproteínas no es capaz de inhibir la captación de liposomas, tal como se indicó mediante la administración funcional de ARNip a las células estimuladas.

Objeto de la invención

Por tanto, ha sido un objeto de la invención proporcionar liposomas que puedan transfectar células en presencia de diversos sueros.

Otro objeto de la invención es proporcionar las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos liposomas en forma de un vehículo para la administración de agentes o ingredientes activos, incluyendo fármacos tales como fármacos de ácidos nucleicos, por ejemplo, oligonucleótidos y plásmidos en células o tejidos.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona ensamblajes de lípidos, liposomas y su uso para la transfección de células de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5 y 11. Se describen realizaciones ventajosas adicionales de la invención en las reivindicaciones dependientes.

Se ha encontrado que se puede conseguir una transfección resistente al suero con liposomas que tienen una superficie externa que comprende una mezcla de restos aniónicos y catiónicos; en la que al menos una porción de los restos catiónicos son grupos guanido.

Descripción detallada de la invención

Las lipoproteínas que competen con la transfección de liposomas comprenden una variedad de

estructuras, de acuerdo con su densidad, estas se denominan partículas quilomicrones, VLDL, LDL, IDL o HDL. En la ruta endógena, los quilomicrones se sintetizan en el revestimiento epitelial del intestino delgado y se ensamblan utilizando ApoB-48, una variante más corta del producto del gen ApoB. El intercambio adicional de lipoproteínas con partículas HDL conduce a la transferencia de ApoC-II y ApoE hasta la partícula quilomicrónica, mediando la primera 5 la activación de la lipoproteína lipasa, una enzima necesaria para la liberación de los lípidos de la partícula. Los quilomicrones hidrolizados forman los denominados restos, que se capturan principalmente en el hígado mediante el reconocimiento de su porción ApoE. La síntesis, maduración, uso y recirculación de las partículas VLDL sigue la misma ruta, pero se inicia en el hígado y utiliza la proteína ApoB-100 como su unidad formadora de estructura. De nuevo, ApoE media la eventual captación y recirculación de los restos de VLDL, las partículas denominadas como

IDL (véase también http: //en.wikipedia.org/wiki/Lipoprotein) .

ApoE comparte homología estructural con las apolipoproteínas A y C en que todas comprenden

repeticiones en tándem anfifáticas de 11 aminoácidos. Los datos cristalográficos confirman la existencia de

estructuras helicoidales anfifáticas extendidas para el fragmento ApoA-I y ApoE y desvelan también una 15 organización de carga mixta en la cara polar de estas hélices. Estos datos están públicamente disponibles en el

banco de Datos de la Proteína RCSB (http: //www.rcsb.orp/pdb/home/home.do) y la entrada 1AV1.pdb proporciona

la estructura de la proteína de ApoA-I. Los aminoácidos 129 a 166 de 1lpe.pdb representan el fragmento de unión

del receptor LDL de ApoE. En contraste a su similitud global, las tres apolipoproteínas muestran desviaciones

específicas cuando se analiza su composición de aminoácidos. En ApoE, la arginina es el aminoácido catiónico que 20 prevalece en las repeticiones en tándem. En contraste, ApoA tiene cantidades iguales de lisina y arginina mientras

que ApoC tiene un exceso de restos de lisina.

Tabla 1: Análisis de la composición de aminoácidos en repeticiones en tándem de apolipoproteínas relacionadas. Se obtuvieron datos de las secuencias de Swiss-Prot (http: //www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html) .

En resumen, la superficie polar de las lipoproteínas naturales está cubierta con apolipoproteínas, de las cuales ApoE es un motivo de unión común para la captación celular de estas partículas. Las porciones de ApoE expuestas al agua representan un mosaico de cargas aniónicas y catiónicas, en que las cargas aniónicas se crean a partir de los extremos carboxilo libres de restos de ácido aspártico y glutámico. Las cargas catiónicas comprenden

una mezcla de grupos amino y guanido estando presentes muy pocos imidazoles.

A fin de emular el modelo de reconocimiento del casete de unión de ApoE sobre la superficie de los liposomas, se pueden seguir diferentes alternativas. Es bien posible sintetizar el fragmento del péptido ApoE e injertar dichos péptidos en la superficie de liposomas. Esto ha sido demostrados por Mims y col., J Biol. Chem. 269,

20539 (1994) ; Rensen y col., Mol Pharmacol. 52, 445 (1997) ; Rensen y col., J. Lipid Res. 38, 1070 (1997) ; Sauer y col., Biochemistr y 44, 2021 (2005) o Versluis y col., J Pharmacol. Exp. Ther 289, 1 (1999) .

Una presentación directa de los restos cargados digeridos utilizando mezclas de diferentes lípidos cargados, que comprenden potencialmente de manera adicional lípidos neutros, darían como resultado una

estructura mucho más... [Seguir leyendo]

1. Un ensamblaje de lípidos que comprende un lípido catiónico que comprende un resto guanido y un lípido aniónico que comprende un grupo carboxilo, caracterizado además porque la relación entre el resto guanido del lípido catiónico y el grupo carboxilo del lípido aniónico es menor o igual a 1, 5.

2. Un ensamblaje de lípidos tal como en la reivindicación 1, caracterizado además porque el ensamblaje comprende cantidades molares aproximadamente iguales del resto guanido y del grupo carboxilo.

3. Un ensamblaje de lípidos tal como en la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho ensamblaje comprende un exceso molar del grupo carboxilo sobre el resto guanido.

4. Un ensamblaje de lípidos tal como en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque dicho ensamblaje es un liposoma.

5. Un liposoma tal como en la reivindicación 4, que comprende además un lípido neutro o de ion híbrido seleccionado entre colesterol, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina o sus mezclas.

6. Un liposoma tal como en la reivindicación 4 o la reivindicación 5, que comprende además restos PEG injertados en su fase lípida.

7. Un liposoma tal como en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un ingrediente farmacéutico activo.

8. Un liposoma tal como en la reivindicación 7, en el que dicho ingrediente farmacéutico es un oligonucleótido.

9. Un liposoma tal como en la reivindicación 8, en el que dicho oligonucleótido es un oligonucleótido señuelo, y un oligonucleótido de sentido contrario, un ARNip, un agente que influencia la transcripción, una ribozima, una ADNzima o un aptámero.

10. Un liposoma tal como en la reivindicación 8, en el que dichos oligonucleótidos comprenden nucleósidos modificados tales como ADN, ARN, LNA, PNA, 2’OMe ARN, 2’ MOE ARN, 2’F ARN en sus formas de fosfodiéster o fosfotioato.

11. Un liposoma tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para uso en la transfección de células in vivo.

12. Uso del liposoma tal como se ha reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la transfección de células in vitro o ex vivo.