PROCEDIMIENTO PARA EL RECUBRIMIENTO DE MEMBRANAS.

Procedimiento para la aplicación de películas reactivas con un contenido en sólidos sobre membranas separadoras de la sangre,

microporosas, absorbentes, en donde la película reactiva con un contenido en sólidos es una película impermeable, insoluble en agua, la cual contiene en una matriz hidrófoba de formadores de película, todos o por lo menos parte, de los reactivos de detección para el analito que se va a analizar, y presenta una alta proporción de abridores de película, referida a la cantidad de formadores de película, caracterizado porque, los abridores de película son partículas inorgánicas u orgánicas, finas, que se humectan bien, que no se hinchan, insolubles en agua y que ópticamente no están o están muy poco dispersadas, las cuales hacen posible la rápida penetración también de grandes moléculas o células en las películas reactivas con un contenido en sólidos, y las cuales están en una relación entre la masa de abridores de película y la masa de los formadores de película, de 10:1 a 1:1 en la película reactiva, y la membrana se humecta en primer lugar con agua o una solución acuosa, y la película reactiva con un contenido en sólidos se aplica sobre la membrana todavía húmeda.

Procedimiento para el recubrimiento de membranas La invención se refiere a un procedimiento para la aplicación de películas reactivas con un contenido en sólidos, sobre membranas microporosas, a las correspondientes membranas producidas, y a los medios de diagnóstico contenidos en las mismas.

Para la determinación analítica, cualitativa o cuantitativa, de los componentes de los líquidos, en particular de los líquidos corporales como la sangre, se emplean a menudo los llamados ensayos vinculados a un soporte. En su caso, los reactivos, en particular los reactivos específicos de detección y reactivos auxiliares se incrustan o se fijan en las correspondientes capas de un soporte sólido. Estas capas reciben el nombre de elementos de detección. Para la determinación del correspondiente analito se pone en contacto la muestra líquida que lo contiene con estos elementos de detección. La reacción de la muestra líquida y de los reactivos que al principio están en forma seca y que luego se disuelven en la muestra, conduce en presencia de algún analito diana, por regla general a una señal detectable óptica o electroquímicamente, en particular un cambio de color que puede ser evaluado visualmente o con la ayuda de un aparato, la mayor parte de las veces un aparato de reflexión fotométrica. Otros métodos de detección se basan por ejemplo en métodos electroquímicos y comprenden las variaciones de la carga, del potencial o de la intensidad de la corriente.

Dado que los reactivos de detección -a diferencia de los ensayos de laboratorio convencionales - se encuentran al principio en forma anhidra, se habla a menudo de los ensayos vinculados a un soporte también como de "ensayos químicos en seco".

Los elementos de ensayo o soportes de ensayo para ensayos químicos en seco están a menudo formados como tiras de ensayo, y constan esencialmente de una capa soporte longitudinal de un material plástico, sobre la cual están aplicados los elementos de detección como campos de ensayo. Sin embargo, se conocen también soportes de ensayo que tienen forma de plaquitas cuadradas o rectangulares.

La detección fotométrica de los analitos de la sangre de bajo peso molecular mediante tiras de ensayo de química seca comprende normalmente la previa separación de los eritrocitos que estorban la medición fotométrica.

Las enzimas necesarias para la detección analítica se encuentran normalmente en una película insoluble en agua, impermeable, en la cual una matriz hidrófoba que consta de formadores de película contiene todos o por lo menos una parte de los reactivos de detección (es decir, esencialmente enzimas y el sistema indicador) , penetran en la muestra y tiene lugar la reacción que genera un color. Estas películas se aplican por medio de diferentes procedimientos de recubrimiento ya conocidos (por ejemplo, con rasqueta) sobre materiales de soporte no absorbentes, mecánicamente estables, (como por ejemplo, láminas de Pokalon® de policarbonato de bisfenol-A.

Bajo el concepto de formadores de película se comprenden aquellos polímeros que permiten el recubrimiento mecánicamente estable de capas de reactivos resistentes al agua (por ejemplo el Propiofan®, una dispersión de propionato de vinilo en una substancia plástica) .

Por otra parte, estas películas reactivas contienen normalmente substancias absorbentes que se hinchan. Las substancias absorbentes que se hinchan son polímeros solubles en agua que influyen significativamente sobre la viscosidad de la masa de recubrimiento, que actúan dividiendo finamente los reactivos en las zonas hidrófobas parciales de la capa impermeable, y que facilitan la penetración de la muestra en la capa (como ejemplo, pueden citarse, el alginato, el Keltrol®, el Gantrez®, el Eudragit, etc.) .

La "porosidad abierta" y con ello la penetración del analito en la película reactiva puede ser influenciada positivamente mediante la adición de substancias de relleno (llamadas también "abridores de película") (véase por ejemplo la patente US 4. 312. 834) . Las substancias de relleno son partículas inorgánicas u orgánicas finas, ópticamente no dispersantes o muy poco dispersantes, insolubles en agua, no absorbentes, no hinchantes, buenas humectantes, que permiten la rápida penetración incluso de grandes moléculas (por ejemplo lípidos en forma de lipoproteínas) e incluso de células (por ejemplo eritrocitos) en las películas impermeables al agua. Como ejemplo de substancias de relleno, pueden citarse la creta, la celulosa, la tierra de diatomeas, el Celatom, el Kieselgur, el ácido silícico, etc.

En la primera generación de tiras ensayo para la determinación de glucosa en sangre (por ejemplo el HÃmoglucotest 20-800, ver también patente US 3. 630. 957) , la película reactiva contiene junto con la química de detección solamente un formador de película (Propiofan®) y una substancia absorbente hinchante (alginato) . En estas películas muy tupidas, es decir películas de poros poco abiertos, resistentes al limpiado con un trapo, los eritrocitos no pueden penetrar en la película reactiva y en cambio sí pueden hacerlo los componentes de la sangre de bajo peso molecular, como en particular la glucosa. En consecuencia no es necesaria una previa separación de la sangre por separado. Las gotas de sangre a partir de las cuales debe determinarse la glucosa en sangre, se aplican directamente sobre la capa reactiva de la tira de ensayo. Después de un minuto de incubación de la gota de sangre sobre la película reactiva se limpia la sangre, y a continuación, después de otro minuto de tiempo de reacción, puede efectuarse ya la lectura del desarrollo de color como una medida de la concentración del analito, en la misma cara de la tira sobre la cual se ha aplicado antes la sangre.

Con ello es posible en primer lugar, detectar la glucosa directamente a partir de la sangre completa. Puesto que esta película reactiva no contiene substancias de relleno, permite solamente la lenta penetración de analitos solubles en agua de bajo peso molecular como por ejemplo, la glucosa pero no es posible la detección de moléculas más grandes e hidrófobas (como por ejemplo la colesterina (CHOL) , la HDL ("High density lipoprotein", es decir las lipoproteínas de alta densidad) , los triglicéridos (TG) , la creatinaquinasa (CK) , etc.) .

Un hito en el desarrollo de los ensayos de química seca para la detección analítica a partir de la sangre completa, lo constituyó el empleo de la napa de fibras de vidrio para la separación de los eritrocitos (ver a este respecto entre otras, la patente US 4.816.224) , en especial en combinación con películas reactivas de poro abierto conteniendo substancias sólidas (por ejemplo las tiras de ensayo de la línea de productos Reflotron de Roche Diagnostics y más tarde los llamados "Non-Wipe-Teste" ("ensayos sin limpiar") de la línea Accutrend de Roche Diagnostics) . Junto a cinéticas claramente más rápidas - en particular por lo que se refiere a la penetración del analito en la película de detección, a la reacción enzimática y a la reacción cromática - este tipo de ensayos permiten también la detección de moléculas hidrófobas relativamente más grandes (por ejemplo, CHOL, HDL, TG, etc.) .

Una desventaja de la tecnología con napa de fibra de vidrio consiste sin embargo en la relación relativamente desfavorable entre el volumen de plasma utilizable y el volumen de sangre empleado (de aquí en adelante, llamado también rendimiento sangre/plasma) . Además, se demuestra en la detección oxidante del analito (es decir, en la detección del analito mediante la oxidasa de analito y la reacción del peróxido de hidrógeno con peroxidasa en presencia de un indicador, el cual pasa de una forma reducida (incolora la mayor parte de veces) a una forma oxidada (coloreada la mayor parte de las veces) , en particular en las llamadas estructuras apiladas (la napa de fibra de vidrio para la separación de los eritrocitos y la película reactiva forman un conjunto apilado; sobre la napa de fibra de vidrio se aplica la muestra de sangre, ésta penetra dentro de la napa de fibra de vidrio con separación de las células rojas de la sangre, y el suero o respectivamente el plasma penetra en la capa de película reactiva que está situada debajo, en donde tiene lugar la propia reacción de detección y del indicador, la cual puede observarse en la cara opuesta a la cara de aplicación de la sangre del grupo apilado) , teniendo como limitación el aporte de oxígeno a la película reactiva, de manera que solamente puede lograrse una zona de medición limitada hacia arriba.

1. Procedimiento para la aplicación de películas reactivas con un contenido en sólidos sobre membranas separadoras de la sangre, microporosas, absorbentes, en donde la película reactiva con un contenido en sólidos es una película impermeable, insoluble en agua, la cual contiene en una matriz hidrófoba de formadores de película, todos o por lo menos parte, de los reactivos de detección para el analito que se va a analizar, y presenta una alta proporción de abridores de película, referida a la cantidad de formadores de película, caracterizado porque, los abridores de película son partículas inorgánicas u orgánicas, finas, que se humectan bien, que no se hinchan, insolubles en agua y que ópticamente no están o están muy poco dispersadas, las cuales hacen posible la rápida penetración también de grandes moléculas o células en las películas reactivas con un contenido en sólidos, y las cuales están en una relación entre la masa de abridores de película y la masa de los formadores de película, de 10:1 a 1:1 en la película reactiva, y la membrana se humecta en primer lugar con agua o una solución acuosa, y la película reactiva con un contenido en sólidos se aplica sobre la membrana todavía húmeda.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque, la película reactiva contiene formadores de película, abridores de película en forma de partículas inorgánicas u orgánicas, y eventualmente pigmentos que forman una barrera óptica.

3. Procedimiento según una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque, la película reactiva se aplica inmediatamente sobre la membrana después de la humectación de la película.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque, la humectación de la membrana tiene lugar mediante inmersión en una tina.

5. Procedimiento según una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque, el agua o la solución acuosa contiene un humectante.

6. Procedimiento según una de las precedentes reivindicaciones, caracterizado porque, la aplicación de la película reactiva se efectúa mediante un recubrimiento con rasqueta o mediante un recubrimiento con una boquilla con ranura.

7. Membrana separadora de la sangre, microporosa, absorbente, la cual está recubierta con una película reactiva con un contenido en sólidos, en donde la película reactiva con un contenido en sólidos es una película impermeable, insoluble en agua, la cual contiene en una matriz hidrófoba de formadores de película, todos o por lo menos parte, de los reactivos de detección para un analito que se va a detectar, la cual es ópticamente no dispersante o poco dispersante, insoluble en agua, no se hincha, se humecta bien, fina, partículas inorgánicas u orgánicas, y la cual permite la rápida penetración también de grandes moléculas o células en la película con un contenido de sólidos, caracterizada porque, la relación de masas entre los abridores de película y los formadores de película es de 10:1 a 1:1.

8. Membrana según la reivindicación 7, caracterizada porque, la relación de masas entre los abridores de película y los formadores de película es de 5:1 a 2:1.

9. Agente de diagnóstico para la detección de componentes de líquidos corporales, el cual contiene una membrana recubierta con una película reactiva según una de las reivindicaciones 7 a 8.