DISPOSITIVO INDUCTIVO DETECTOR DE PRESENCIA.
Dispositivo inductivo detector de presencia bacteriana.
La invención se refiere a un novedoso dispositivo (1) para la detección de presencia bacteriana que comprende dos transductores inductivos similares configurados de modo que uno de ellos puede quedar libre a la vez que el otro es expuesto a una solución,
y que están adaptados para su conexión a un analizador de impedancias, deduciéndose de la variación de la impedancia del transductor inductivo cuando se expone a una solución la presencia o ausencia de bacterias en dicha solución.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201030031.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: MUÑOZ PASCUAL,FCO. JAVIER, BALDRICH RUBIO,EVA, MARTINEZ MENDIZABAL,SUSANA.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12M1/34 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12M EQUIPOS PARA ENZIMOLOGIA O MICROBIOLOGIA (instalaciones para la fermentación de estiércoles A01C 3/02; conservación de partes vivas de cuerpos humanos o animales A01N 1/02; aparatos de cervecería C12C; equipos para la fermentación del vino C12G; aparatos para preparar el vinagre C12J 1/10). › C12M 1/00 Equipos para enzimología o microbiología. › Medida o ensayo de detección de las condiciones del medio, p. ej. por contadores de colonias.
- G01N27/74 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 27/00 Investigación o análisis de materiales mediante el empleo de medios eléctricos, electroquímicos o magnéticos (G01N 3/00 - G01N 25/00 tienen prioridad; medida o ensayo de variables eléctricas o magnéticas o de las propiedades eléctricas o magnéticas de los materiales G01R). › de fluidos (G01N 24/00 tiene prioridad).
- G01N33/487 G01N […] › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › de material biológico líquido.
Fragmento de la descripción:
Dispositivo inductivo detector de presencia bacteriana.
Objeto de la invención
Un primer objeto de la presente invención es un dispositivo inductivo para la detección de presencia bacteriana en una muestra de una forma rápida y sencilla.
Un segundo objeto de la presente invención es un procedimiento para la detección de presencia bacteriana en una muestra empleando el dispositivo detector anterior.
Estado de la técnica
La detección rápida y sensible de presencia bacteriana es un requisito clave para la prevención eficaz de un importante número de problemas sanitarios y medioambientales. Sin embargo, aunque simple en concepto, este objetivo se enfrenta todavía con grandes desafíos.
La mayoría de los métodos de detección actualmente disponibles se fundamentan en técnicas clásicas como el cultivo, las pruebas bioquímicas y la enumeración por microscopia o por citometría de flujo, que aunque extremadamente sensibles, requieren de largos tiempos de ensayo, laboratorios adecuados, instrumentación costosa y personal altamente especializado.
Recientes avances en métodos alternativos, incluyendo las técnicas inmunológicas (inmunoensayos, separaciones inmunomagnéticas), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la espectrometría de masas, así como el floreciente campo de los microarrays de ADN, están sentando las bases para el desarrollo de kits comerciales y sistemas de detección portátiles de manejo más sencillo. Sin embargo, muchos de estos métodos aún son complejos y requieren tiempos de análisis excesivamente largos.
Por otro lado, la determinación de la conductividad de las partículas bacterianas es una fuente importante de información sobre el estado fisiológico de la célula. La conductividad de las partículas bacterianas está determinada principalmente por el número de grupos cargados presente en la pared celular (de estructura gel-porosa) y por la movilidad de los contraiones desde/hacia ella. Sus valores experimentales han sido obtenidos mediante diferentes técnicas, entre las cuales se puede citar el artículo de A. Vander Wal, M. Minor, W. Norde, A. J. B. Zehnder y J. Lyklema, J. Colloid Interface Sci., 1997, 186, 71-79. VanderWal y colaboradores observaron que la conductividad de la superficie de las bacterias en suspensión tiende a aumentar ligeramente con la concentración de electrolito en solución. Sin embargo, la conductividad de las células resultó insignificante en comparación con la solución electrolítica tanto a las más altas como a las más bajas concentraciones de electrolito ensayadas. Mientras que el primero es el comportamiento esperado para suspensiones diluidas de partículas esféricas no conductoras y no cargadas, la segunda observación se atribuyó a la fuga de iones a través de la membrana citoplasmática. En consecuencia, las estimaciones de estos autores para la conductividad de las células, que son equivalentes a las de una solución electrolítica de unos 1-5 mM, resultaron más fiables medidas en presencia de electrolitos a concentración 0.01-0.04 M.
Posteriormente, se demostró que la conductividad del espacio periplásmico bacteriano aumenta con la raíz cuadrada de la fuerza iónica del medio (Hötzel, Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res., 1999, 1450, 53-60).
Más recientemente, Suehiro detectó un aumento en la conductancia tras la concentración de E. coli por dielectrophoresis sobre la superficie de arrays de microelectrodos interdigitados (J Suehiro, R. Hamada, D. Noutomi, M. Shutou y M. Hara, J. Electrost., 2003, 57, 157-168). Además, el incremento en conductancia resultó directamente proporcional a la cantidad de bacterias capturadas.
Descripción de la invención
La presente invención describe una nueva estrategia para la detección de presencia bacteriana en una solución utilizando transductores inductivos. En efecto, la conductividad de la pared bacteriana contribuye a aumentar la conductividad global de una solución, lo cual provoca un cambio del campo magnético alrededor del transductor inductivo y, por tanto, también de su inductancia. Una sencilla y rápida medición de la inductancia de un transductor inductivo expuesto a una solución proporciona así información acerca de la conductividad de dicha solución. Las ventajas de esta estrategia de medida son un tiempo de respuesta extremadamente rápido, un formato de ensayo sin reactivo ni marcador, y la explotación de dispositivos altamente compatibles con la producción en masa y de bajo coste.
En particular, los transductores inductivos empleados en la presente invención son bobinas inductivas. La inductancia L de una bobina depende de su composición y diseño, aunque también cambia en presencia de metales en su proximidad o cuando se producen cambios en factores externos como la luz o la temperatura. Estos cambios en la inductancia dificultan la adquisición de señales coherentes o reproducibles a lo largo del tiempo (por ejemplo, obtenidas en días diferentes o en localizaciones dispares), dificultando así su uso como sensor en determinadas aplicaciones. Además, bobinas microfabricadas mediante tecnología CMOS y situadas en posiciones alejadas dentro de una misma oblea de silicio suelen presentar ligeras diferencias de composición y por tanto distinto comportamiento.
Sin embargo, se ha comprobado que la relación entre las inductancias de bobinas adyacentes en la oblea se mantiene prácticamente constante entre ciertos límites de temperatura. Esto es debido en parte al hecho de que bobinas adyacentes tienden a mostrar características similares al haber sido fabricadas a la vez y en similares condiciones. Además, el efecto de los factores externos es similar en dos bobinas cercanas y condiciona de la misma forma la respuesta de ambas, algo que se traduce en valores cercanos de la inductancia y resistencia. El dispositivo de la presente solicitud aprovecha estas características para realizar medidas diferenciales de inductancia: una primera bobina o bobina activa se pone en contacto con una solución y se mide su inductancia, esta medida se corrige respecto a la de una segunda bobina o bobina de referencia para compensar cambios en las condiciones ambientales, y finalmente la medida de inductancia de la bobina activa ya
Según un primer aspecto de la invención, se describe un dispositivo detector de presencia bacteriana que comprende dos transductores inductivos similares entre sí configurados de modo que uno de ellos puede quedar libre a la vez que el otro es expuesto a una solución. En el presente documento, denominaremos transductor inductivo de referencia al transductor que queda libre durante el procedimiento de medida, mientras que el transductor inductivo expuesto a la solución se denominará transductor activo. Además, el dispositivo de la invención está adaptado para su conexión a un analizador de impedancias para llevar a cabo las medidas de inductancia de los transductores inductivos a partir de las cuales se deducirá la presencia bacteriana o no en la solución problema y, en su caso, la concentración de bacterias de acuerdo con el procedimiento que se describirá más adelante.
Aunque el dispositivo de la invención se puede realizar utilizando cualquier tipo de transductor inductivo cuya inductancia varíe cuando se modifica el campo magnético a su alrededor, de acuerdo con una realización preferente de la invención los transductores inductivos son bobinas inductivas cubiertas por una capa aislante. Las bobinas inductivas pueden estar individualizadas, es decir, formadas cada una sobre un sustrato diferente para facilitar la deposición de una solución solamente sobre la bobina activa o para permitir la toma de medidas por inmersión diferencial de las dos bobinas en una solución, o bien estar formadas adyacentes y coplanares sobre un mismo sustrato. Se entiende que, aunque la configuración básica de este dispositivo se realiza con un mínimo de dos bobinas, una de referencia y otra activa, es posible fabricar un dispositivo que disponga de un número variable de bobinas de referencia y de un número variable de bobinas activas para facilitar la toma simultánea de varias medidas.
Por otro lado las bobinas de la invención pueden ser de cualquier tamaño siempre que permitan que un volumen de solución cubra completamente la bobina activa, modificando así su inductancia para realizar la medida. Del mismo modo, la distancia entre las dos bobinas deberá ser suficiente como para exponer la bobina activa...
Reivindicaciones:
1. Dispositivo (1) detector de presencia bacteriana, caracterizado porque comprende dos transductores inductivos similares configurados de modo que uno de ellos puede quedar libre a la vez que el otro es expuesto a una solución, y que están adaptados para su conexión a un analizador de impedancias.
2. Dispositivo (1) detector de presencia bacteriana de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque los transductores inductivos son bobinas (2A, 2B) cubiertas por una capa aislante.
3. Dispositivo (1) detector de presencia bacteriana de acuerdo con la reivindicación 2, donde las bobinas (2A, 2B) están dispuestas adyacente y coplanarmente sobre el mismo sustrato (3).
4. Dispositivo (1) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-3, que además comprende un anillo de guarda conectado a masa alrededor de cada bobina (2A, 2B) para reducir posibles fugas de corriente.
5. Dispositivo (1) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde el radio de las bobinas (2A, 2B) está comprendido entre 100 μm y 1000 μm.
6. Procedimiento de detección de presencia bacteriana en una solución problema empleando un dispositivo (1) que comprende un par de bobinas (2A, 2B), respectivamente bobina activa y bobina de referencia, cubiertas por una capa aislante y conectadas a un analizador de impedancias, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
- realizar al menos una medida de inductancia con ambas bobinas (2A, 2B) en contacto con una solución de referencia sin bacterias, obteniéndose las inductancias de referencia LAref, LBref de las bobinas (2A, 2B);
- realizar una medida de las inductancias LAmed, LBmed de las bobinas (2A, 2B) con la bobina (2A) activa en contacto con la solución problema y la bobina (2B) de referencia en contacto con la solución de referencia sin bacterias; y
- deducir la presencia y/o concentración de bacterias en la solución problema en función del cambio de inductancia de la bobina (2A) activa.
7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, donde el cambio de inductancia de la bobina (2A) activa se obtiene restando su inductancia de referencia LAref de su inductancia de medida LAmed corregida para compensar cambios ambientales.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, donde el cambio de inductancia de la bobina (2A) activa se obtiene de acuerdo con la siguiente fórmula:
9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, donde las medidas de inductancia se realizan a frecuencias de entre 4 MHz y 20 MHz.
10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, donde las medidas de inductancia se realizan a frecuencias de entre 4 MHz y 10 MHz.
11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-10, donde la solución de referencia sin bacterias es una solución salina o un medio de cultivo bacteriano.
12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, donde la solución salina es una solución salina PBS.
13. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-12, donde la solución problema es una solución salina o un medio de cultivo bacteriano.
14. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, donde la solución salina es una solución salina PBS.
15. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-14, donde la solución de referencia se obtiene a partir de la matriz de la solución problema previamente sometida a depleción de presencia bacteriana.
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