Un método in vitro para determinar la sensibilidad de un sujeto a un tratamiento quimioterápico del cáncer seleccionado de una antraciclina,

oxali-platino y cis-platino, cuyo método comprende detectar la presencia de un ácido nucleico de receptor 4 similar a Toll (TLR4) mutado o una expresión o actividad anormal de la proteína TLR4 en una muestra del sujeto, y la presencia de dicho ácido nucleico de TLR4 mutado o expresión o actividad anormal de TLR4 es indicativa de una resistencia a dicho tratamiento.

Disfunción del receptor 4 similar a Toll y aplicaciones biológicas de la misma.

La presente descripción se refiere en general a los campos de la genética, inmunología y medicina. Los inventores describen más en particular la identificación de un gen humano que se puede usar para predecir o determinar la sensibilidad de un sujeto a un tratamiento del cáncer. Este gen humano se ha identificado además en la presente memoria como un gen de susceptibilidad al cáncer que se puede usar para la prevención y el tratamiento del cáncer, así como para el cribado de fármacos terapéuticamente activos.

La presente descripción se refiere más específicamente a un gen del receptor 4 similar a Toll (TLR4) anormal que codifica una proteína TLR4 mutante, y dicho gen y proteína mutados representan objetivos nuevos para la intervención terapéutica. Un mutante de TLR4 particular comprende preferiblemente una única mutación de la asparagina de la posición 299.

La descripción se refiere además a una expresión o actividad anormal de la proteína TLR4.

También se describen métodos para determinar la predisposición hacia un cáncer en un sujeto y/o para prevenir o tratar el cáncer.

TÉCNICA ANTECEDENTE

Las respuestas inmunitarias innatas a patógenos las organizan principalmente los monocitos, macrófagos, granulocitos y células dendríticas, que actúan como una primera línea de defensa contra los microorganismos invasores [1]. La distinción entre lo que es propio y lo que es ajeno se basa en proteínas del hospedador que poseen la capacidad de reconocer patrones moleculares presentes en los organismos exógenos [2] [3]. Una familia importante de proteínas son los receptores similares a Toll (TLR) , también denominados receptores de reconocimiento de patrones (PRR) .

TLR4 reconoce lipopolisacáridos (LPS) de bacterias gramnegativas, por medio de un dominio extracelular caracterizado por repeticiones ricas en leucina [4], [5], [6]. Tras su unión a la proteína de unión a LPS (LBP) , el LPS se transporta a un complejo receptor que implica CD14, TLR4 y una molécula adaptadora MD2. La transducción de señales se inicia mediante la interacción del dominio TIR (Toll/receptor de IL-1) de TLR4 con MyD88 (proteína de respuesta principal de diferenciación mieloide 88) [7]. Se ha dilucidado una ruta independiente de MyD88 para TLR4, que implica proteínas tales como la proteína adaptadora que contiene un dominio Toll-IL1R que induce IFN beta (TRIF) , moléculas adaptadoras relacionadas con TRIF, quinasa 1 de unión a TANK (TANK: NFKB quinasa asociada al receptor de TNF) e IKB quinasa E, que conduce después a la inducción de IFN de tipo 1 por medio del factor 3 regulador de interferón (IRF3) [8], [9], [10], [11].

Los polimorfismos genéticos, en su mayoría polimorfismos de nucleótido simple (SNP) , son variantes comunes en una población que se hallan con una frecuencia de más del 1%. Pueden alterar la secuencia de aminoácidos (SNP no sinónimo) , afectar al promotor o dar una secuencia sinónima. Se han identificado dos SNP en la región del promotor de CD14 y uno de ellos, Cys159Thr, está relacionado con la incidencia y la mortalidad del choque séptico [12].

De manera más importante, se han investigado en gran medida los SNP en el dominio extracelular de TLR4. Dos SNP que co-segregan en el gen que codifica TLR4 que exhiben frecuencias alélicas mayores del 2% son Asp299Gly y Thr399Ile [13]. Estas mutaciones se hallaron en alrededor del 10% (0-19%) de los individuos blancos de control en la mayoría de los estudios. La importancia funcional del SNP Asp299Gly se ha investigado en la hiposensibilidad a LPS inhalado y en asmáticos alérgicos [13], sobre la incidencia y el curso del choque séptico y en diversas enfermedades infecciosas o en la patogénesis de la aterosclerosis. Los datos crecientes pero controvertidos apuntan a un papel de dicho SNP de TLR4 en la susceptibilidad alterada o en el curso de estas enfermedades inflamatorias o infecciosas (que incluyen reacciones a aloinjertos, diabetes, estenosis coronaria) (revisado en [14]) . Es necesario un alelo mutado para la disfunción [13]. De 91 personas con choque séptico durante una infección por bacterias gramnegativas, 4 exhibieron el SNP Asp299Gly (pero no el Thr399Ile) , mientras se detectaron 0 SNP en el grupo de control [15]. La colonización de mujeres gestantes con Gardnerella spp y otros comensales gramnegativos se incrementó 10 veces en mujeres que portaban el alelo mutado de TLR4 Thr399Ile [16]. Se descubrió una correlación clara entre la bronquiolitis aguda por virus sincitial respiratorio (RSV) en niños y ambos SNP de TLR4, a la vez que no se descubrió ninguna correlación con SNP de CD14 [17].

El bloqueo de TLR4 puede tener un efecto beneficioso sobre la aterosclerosis en ratones, y dos estudios descubrieron un efecto protector de las variantes de TLR4 en episodios coronarios agudos [18], [19], [20]. Los SNP infrecuentes de TLR4 también podrían ser importantes en algunos casos, tales como meningococcemia en la que Asp299Gly/Thr399Ile no fueron significativos (región extracelular y dominio C-terminal de la región TIR, [21], [22]) .

Los ensayos funcionales mediante el uso de PBMC completos o monocitos dirigidos a detectar TLR4 disfuncional pueden no ser relevantes [23], [24], [25].

La asociación de los SNP con la susceptibilidad a enfermedades infecciosas, así, solamente se puede considerar preliminar, ya que los estudios que informan de correlaciones positivas se llevaron a cabo con poblaciones pequeñas. El hallazgo de que la presencia de SNP no influye en la activación de los monocitos de sangre completa por sus ligandos es una prueba adicional contra la hipótesis de un papel potencial para estos SNP en la susceptibilidad a enfermedades infecciosas.

Recientemente se ha considerado un papel para el polimorfismo de TLR4 y el cáncer, debido a que la inflamación crónica puede exponer a un riesgo superior de tumorigénesis. Se descubrió que un SNP de TLR4 en la posición 11 381 en Suecia era más frecuente (24, 1% frente al 19, 7%, p=0, 02) entre personas con cáncer de próstata [26]. Un estudio más reciente también concluyó que los polimorfismos heredados del gen inmunitario innato de TLR4 están asociados al riesgo de cáncer de próstata [27]. La homocigosidad para los alelos variantes de ocho SNPs se asoció a un riesgo significativamente más bajo estadísticamente de cáncer de próstata (TLR4_1893, TLR4_2032, TLR4_2437, TLR4_7764, TLR4_11912, TLR4_16649, TLR4_17050, y TLR4_17923) , pero el polimorfismo de TLR4_15844 correspondiente a 11381G/C no estuvo asociado al cáncer de próstata (GG frente a CG/CC: OR, 1, 01; intervalo de confianza del 95%, 0, 79-1, 29) . Se observaron seis haplotipos comunes (frecuencia acumulativa, 81%) ; el ensayo global de la asociación entre los haplotipos y el cáncer de próstata fue estadísticamente significativo [chi (2) = 14, 8 en 6 grados de libertad; P = 0, 02]. Dos haplotipos comunes estuvieron estadísticamente asociados de manera significativa a un riesgo alterado de cáncer de próstata.

La primera demostración de un papel modulador para TLR4 en la inflamación pulmonar crónica y la tumorigénesis ha sido presentada por Bauer AK et al. [28]. Para determinar el papel de TLR4 en la inflamación pulmonar crónica, compararon la permeabilidad pulmonar, la infiltración de leucocitos, y el factor nuclear kappa B (NFkappaB) y la unión al ADN de la proteína activadora 1 (AP-1) en cepas de ratones endogámicas tratadas con hidroxitolueno butilado (BHT) con TLR4 funcional (OuJ y BALB) y TLR4 mutado [HeJ y BALB (Lps-d) ]. También midieron la formación de tumores primarios en estos ratones tras una única inyección de carcinógeno (3-metilcolantreno) seguido de tratamiento con BHT. Los ratones con TLR4 funcional tuvieron una permeabilidad pulmonar, inflamación de leucocitos, y formación de tumores primarios reducidas (BALB (Lps-d) , media = 22, 3 tumores/ratón, frente a BALB, media = 13, 9 tumores/ratón, diferencia = 8, 4 tumores/ratón, intervalo de confianza del 95% = 4, 6 a 12, 1 tumores/ratón; P = 0, 025) en comparación con los ratones con TLR4 mutado. La actividad de unión al ADN de NFkappaB fue superior en los ratones OuJ que en los ratones HeJ; sin embargo, la actividad de AP-1 estuvo elevada en los ratones HeJ.

Más recientemente, Okamoto et al. [29], describió una correlación entre la ausencia de expresión de TLR-4 en pacientes con cáncer de cabeza y cuello y una respuesta disminuida a un tratamiento terapéutico particular que comprendía la administración de OK-PSA... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para determinar la sensibilidad de un sujeto a un tratamiento quimioterápico del cáncer seleccionado de una antraciclina, oxali-platino y cis-platino, cuyo método comprende detectar la presencia de un ácido nucleico de receptor 4 similar a Toll (TLR4) mutado o una expresión o actividad anormal de la proteína TLR4 en una muestra del sujeto, y la presencia de dicho ácido nucleico de TLR4 mutado o expresión o actividad anormal de TLR4 es indicativa de una resistencia a dicho tratamiento.

2. Un método in vitro para determinar la sensibilidad de un sujeto a la radioterapia, cuyo método comprende detectar la presencia de un ácido nucleico de un receptor 4 similar a Toll (TLR4) mutado o una expresión o actividad anormal de la proteína TLR4 en una muestra del sujeto, y la presencia de dicho ácido nucleico de TLR4 mutado o la expresión o actividad anormal de TLR4 es indicativa de una resistencia a dicho tratamiento.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el tratamiento incluye además rayos X (RX) .

4. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, estómago, sarcoma, ovárico, endometrio, vejiga, cuello de útero, próstata, recto, colon, pulmón, cáncer ORL, tumores pediátricos (neuroblastoma, glioblastoma multiforme) , linfoma, leucemia, mieloma, seminoma, Hodgkin y hemopatías malignas.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la presencia de un ácido nucleico de TLR4 mutado se detecta mediante el uso de la digestión de restricción, secuenciación, hibridación selectiva y/o amplificación selectiva.

6. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido nucleico de TLR4 mutado es un ácido nucleico de TLR4 de tipo natural que comprende una mutación puntual, preferiblemente un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) que conduce a la sustitución de asparagina por glicina en la posición 299 y/o a la sustitución de treonina por isoleucina en la posición 399.

7. El método de la reivindicación 1 ó 2, cuyo método comprende determinar la expresión de la proteína TLR4 anormal midiendo el nivel celular de mARN que codifica un TLR4 normal, en el que un nivel disminuido en comparación con un nivel de control o patrón se correlaciona con una expresión anormal de la proteína TLR4.

8. El método de la reivindicación 1 ó 2, cuyo método comprende determinar la presencia de una proteína TLR4 anormal, poniendo en contacto la muestra con un ligando identificado para unirse específicamente a tal proteína TLR4 anormal, tal como un anticuerpo específico para dicho TLR4 anormal.

9. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el sujeto se someterá a un trasplante alogénico de médula ósea mediante el uso de la médula ósea de un sujeto donante que tiene una expresión o actividad normal de la proteína TLR4.

Figura 1B