DETECCIÓN DE INFECCIONES PRIMARIAS POR PATÓGENOS.

La presente invención se refiere a un método para detectar y determinar diferencialmente los anticuerpos IgM que resultan de una infección por un patógeno. Además, se proporcionan los reactivos de ensayo para llevar a cabo dicho método. Aparte de la tecnología de PCR, los ensayos inmunológicos todavía desempeñan un importante papel en la serología de la infección. Mediante la determinación específica de las diferentes clases de inmunoglobulina, la inmunología permite analizar el estadio de una enfermedad. Mediante la determinación de los títulos de IgM y de IgG frente a determinados antígenos víricos, resulta posible distinguir entre diferentes estadios de infección, por ejemplo infecciones agudas, infecciones recurrente, infecciones crónicas/persistentes o estadios de enfermedad postinfecciosos. Por ejemplo, las moléculas de IgG contra las glucoproteínas víricas únicamente se generan en un estadio tardío de una infección por citomegalovirus (Schoppel et al., JID 175:533-544, 1997; Eggers et al., J. Med. Virol. 63:135-142, 2001). Un aspecto crucial de una detección específica fiable de IgG e IgM en presencia de la otra clase de inmunoglobulina respectiva es la concentración efectiva de epítopos o la densidad efectiva de epítopos del antígeno de detección. Una concentración de epítopos efectiva elevada se refiere a una densidad de epítopos elevada y a que todos los epítopos son accesibles a la unión de anticuerpos. En contraste con lo anterior, también los agregados de polipéptidos presentan una elevada concentración de epítopos, aunque la concentración efectiva de epítopos es reducida debido a que los epítopos se encuentran parcial o completamente enterrados u ocultos y de esta manera no resultan accesibles a la unión de anticuerpos. Las concentraciones elevada de epítopos son una precondición para un reconocimiento específico de IgM, mientras que las concentraciones reducidas de epítopos son una precondición para el reconocimiento específico de IgG. En un ensayo clásico de IgM de tipo sándwich, que detecta moléculas de IgM contra el antígeno A, se utiliza un antígeno multimérico A como antígeno de captura inmovilizado. El mismo antígeno multimérico A que porta un grupo informador se utiliza como antígeno de detección. El analito IgM se une al antígeno de captura y al antígeno de detección, de manera que el grupo informador queda inmovilizado en una fase sólida (por ejemplo perlas recubiertas de estreptavidina). Con el fin de evitar interferencias de las moléculas de IgG dirigdas contra A, se añade al ensayo un antígeno monomérico A no marcado como agente de eliminación de interferencias (patente WO nº 98/23955, patente US nº 6.489.129 B1). De acuerdo con lo anterior, un ensayo específico de IgG de tipo sándwich (patentes WO nº 98/23961, US nº 6.645.732 B1) puede comprender un antígeno monomérico para la detección de IgG y un antígeno multimérico no marcado para evitar las interferencias con IgM. El principio que permite una detección específica de moléculas de IgM y de IgG se basa en sus estructuras moleculares respectivas. La IgM pentamérica presenta diez paratopos idénticos para la unión de antígenos, mientras que la IgG monomérica presenta únicamente dos sitios de unión en cada molécula. La detección de IgG se basa en la afinidad para el analito, mientras que la detección de IgM se basa en su avidez. En el primer caso, la unión se consigue mediante una interacción de alta afinidad entre epítopo y paratopo (es decir, sitio de unión de antígeno de IgG); en el último caso, se consigue mediante una potenciación cooperativa de varias interacciones de baja afinidad ("avidez" se refiere a que las constantes individuales de disociación no se suman sino que se multiplican, es decir, una interacción relativamente débil, con una kD de ~10 -5 M resulta incrementada por dos sucesos independientes de unión, rindiendo una interacción de alta afinidad, con una kD de ~ 10 -10 M). De esta manera, puede afirmarse como regla general que los antígenos monoméricos se utilizan para la detección de IgG y se utilizan antígenos oligoméricos/multiméricos para la detección de IgM. La oligomerización o multimerización de antígenos puede conseguirse mediante entrecruzamiento químico de antígenos monoméricos con entrecruzantes homobifuncionales o heterobifuncionales. Generalmente, la oligomerización o multimerización puede optimizarse mediante el ajuste de las condiciones de reacción (concentración de proteínas y entrecruzante, pH, temperatura, tasa de agitación y tiempo de reacción), lo que consume mucho tiempo y resulta laborioso. Sin embargo, pueden alcanzarse diferentes grados de entrecruzamiento en diferentes lotes, lo que requiere procedimientos posteriores de fraccionamiento y/o de calibración. Además, un grado más alto de entrecruzamiento normalmente conduce a una reducción de la solubilidad, conduciendo a problemas en el rendimiento del ensayo. De esta manera, se desea encontrar un método mejorado para proporcionar antígenos multiméricos de un modo definido y reproducible. La patente US nº 6.207.420 describe una secuencia de fusión que comprende una proteína portadora que comprende una proteína de E. coli que presenta una probabilidad de solubilidad predicha de por lo menos 90% fusionada con un péptido o proteína heteróloga diana. Preferentemente, el péptido o proteína heteróloga normalmente es insoluble al expresarse en bacterias. 2   La patente WO nº 03/000878 describe una proteína de fusión que comprende por lo menos un polipéptido diana y cadena arriba del mismo por lo menos un chaperón de FKBP, que se selecciona de entre el grupo que consiste de FkpA, SlyD y factor inductor. El polipéptido diana puede ser un producto génico de mamífero o un producto génico de un patógeno de mamífero. La presente invención se refiere a un método y a un reactivo de ensayo para detectar diferencialmente un anticuerpo IgM dirigido contra un patógeno según definen las reivindicaciones. También se da a conocer un polipéptido de fusión que comprende: (i) por lo menos un dominio de multimerización y (ii) una pluralidad de copias de un segmento epítopo procedente de un patógeno. Las moléculas de polipéptido de fusión son capaces de formar un multímero. Un multímero comprende una pluralidad de subunidades monoméricas asociadas mediante interacciones no covalentes a través del dominio de multimerización. El multímero puede formarse mediante, por ejemplo, incubación de moléculas de polipéptido de fusión bajo condiciones adecuadas. Los polipéptidos de fusión son fusiones genéticas que pueden producirse en cantidades elevadas y de calidad reproducible según métodos estándares. Los polipéptidos de fusión y los multímeros formados a partir de los mismos presentan elevadas estabilidad y solubilidad y, de esta manera, son excelentes antígenos de ensayo en métodos de detección de anticuerpos que resultan de una infección por un patógeno. Preferentemente, los polipéptidos de fusión se utilizan en una determinación de anticuerpos IgM, más preferentemente en una determinación diferencial de anticuerpos IgM, todavía más preferentemente en una determinación diferencial de anticuerpos IgM tempranos que se producen en una infección aguda y/o primaria. Los polipéptidos de fusión pueden portar grupos informadores y/o grupos de captura y de esta manera pueden utilizarse como antígenos de detección y/o de captura. Además, los polipéptidos de fusión también resultan adecuados como agentes de eliminación de interferencias. Las moléculas de polipéptido de fusión preferentemente comprenden uno o más dominios de multimerización, más preferentemente un dominio de multimerización. El dominio de multimerización preferentemente se localiza en el extremo N-terminal y/o C-terminal del polipéptido de fusión, más preferentemente en el extremo N-terminal. El dominio de multimerización es una secuencia polipeptídica que permite la multimerización de molécula individuales de polipéptido de fusión, en la que se forma un multímero que comprende una pluralidad de subunidades monoméricas, que se asocian mediante interacciones no covalentes. Las subunidades monoméricas del complejo son proteínas de fusión genética, en las que los residuos aminoácidos individuales se unen mediante enlaces peptídicos. Las subunidades monoméricas del multímero preferentemente son idénticas. Por ejemplo, el dominio de multimerización puede ser un dominio de dimerización, es decir, un dominio que permita la asociación no covalente de dos subunidades; un dominio de trimerización, que permita la asociación no covalente de tres subunidades; un dominio de tetramerización o un dominio de multimerización de orden todavía más alto. Preferentemente, el dominio de multimerización es un dominio... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar diferencialmente un anticuerpo IgM dirigido contra un patógeno en una muestra, en el que la muestra puede comprender un anticuerpo interfiriente seleccionado de entre un anticuerpo IgM interfiriente y/o un anticuerpo IgG interfiriente, comprendiendo las etapas siguientes: (a) incubar dicha muestra con un reactivo de ensayo, que comprende: (i) por lo menos un receptor R 1 que se une específicamente a los anticuerpos IgM, (ii) por lo menos un receptor R 2 , que se une específicamente al anticuerpo IgM que debe detectarse diferencialmente, en el que: R 2 es un antígeno multimérico y porta un grupo informador, (iii) por lo menos un receptor R 3 , que se une específicamente al anticuerpo IgM interfiriente, en el que R 3 es un antígeno multimérico con una densidad o concentración efectiva de epítopos que es por lo menos dos veces inferior a la densidad o concentración de epítopos del receptor R 2 , y (b) que permite que se formen los complejos siguientes: (i) un complejo que comprende R 1 , dicho anticuerpo IgM que debe detectarse diferencialmente y R 2 , portando dicho complejo un grupo informador, (ii) opcionalmente un complejo que comprende R 3 y dicho anticuerpo IgM interfiriente, eliminando de esta manera la unión interfiriente de dicho anticuerpo IgM interfiriente a R 2 , y (c) determinar dicho grupo informador unido mediante R 2 a dicho anticuerpo IgM que debe detectarse diferencialmente, a modo de medida de dicho anticuerpo IgM en dicha muestra. 2. Método según la reivindicación 1, en el que el reactivo de ensayo comprende además: (iv) un receptor R 4 que se une específicamente a un anticuerpo IgG, en el que R 4 es un antígeno monomérico que comprende una única copia de epítopo, y en el que opcionalmente un complejo que comprende R 4 y se permite que se forme dicho anticuerpo IgG interfiriente, eliminando de esta manera la unión interfiriente de dicho anticuerpo IgG interfiriente a R 2 . 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo IgM que debe detectarse es un anticuerpo IgM presente en una etapa temprana o aguda de una infección y en el que el anticuerpo IgM interfiriente es un anticuerpo IgM presente en una etapa tardía de una infección presente o pasada y/o un anticuerpo IgM presente en una infección persistente o recurrente. 4. Método según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo IgM que debe detectarse es un anticuerpo IgM presente en una etapa temprana o aguda de una infección primaria. 5. Método según la reivindicación 3 ó 4, en el que el receptor R2 comprende por lo menos 6 copias de epítopo reconocidos por el anticuerpo IgM que debe detectarse. 6. Método según la reivindicación 5, en el que el receptor R2 comprende por lo menos 8 copias de epítopo reconocidas por el anticuerpo que debe detectarse. 7. Método según la reivindicación 5, en el que el receptor R2 comprende por lo menos 12 copias de epítopo reconocidas por el anticuerpo IgM que debe detectarse. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el receptor R1 es un antígeno multimérico o un anticuerpo anti-IgM humana. 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el receptor R1 porta un grupo de acoplamiento para la inmovilización en una fase sólida. 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el receptor R3 y el receptor R4, en caso de hallarse presente, se preincuban con la muestra antes de añadir los receptores R1 y/o R2. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el receptor R2 es un polipéptido de fusión que comprende: (i) por lo menos un dominio de multimerización, y (ii) una pluralidad de copias de un segmento epítopo procedente de un patógeno. 12. Reactivo de ensayo para detectar diferencialmente un anticuerpo IgM dirigido contra un patógeno en una muestra, en el que: la muestra puede comprender un anticuerpo interfiriente seleccionado de entre un anticuerpo IgM interfiriente y/o un anticuerpo IgG interfiriente, comprendiendo: (i) por lo menos un receptor R 1 que se une específicamente a los anticuerpos IgM, (ii) por lo menos un receptor R 2 , que se une específicamente al anticuerpo IgM que debe detectarse 32   diferencialmente, en el que: R 2 es un antígeno multimérico y porta un grupo informador, (iii) por lo menos un receptor R 3 , que se une específicamente al anticuerpo IgM interfiriente, en el que R 3 es un antígeno multimérico con una densidad o concentración efectiva de epítopos que es por lo menos dos veces inferior a la densidad o concentración de epítopos del receptor R 2 . 13. Reactivo de ensayo según la reivindicación 12, que comprende adicionalmente: (iv) un receptor R4 que se une específicamente a un anticuerpo IgG, en el que R4 es un antígeno monomérico que comprende una única copia de epítopo. 14. Reactivo de ensayo según la reivindicación 12 ó 13, en el que el receptor R1 es un antígeno multimérico o un anticuerpo anti-IgM humana. 33   34     36