Cultivo de células inductoras de cabello.

Un procedimiento de cultivo de células de la papila dérmica (PD) y/o células de la vaina dérmica (VD) de unaespecie de mamífero,

en el que el procedimiento comprende las etapas de cultivar y subcultivar las células PD y/olas células VD en un medio de cultivo celular constituido por, o complementado con, un medio acondicionadomediante una o más células epiteliales prostáticas o fibroblastos dérmicos humanos, de modo que las células PD y/olas células VS proliferan al tiempo que conservan su potencial inductor del cabello.

Cultivo de células inductoras de cabello

La presente invención se refiere al cultivo de células para usar en la inducción del cabello. En concreto, la invención se refiere a un procedimiento para cultivar células inductoras de cabello (por ejemplo células de la papila dérmica y/o células de la vaina dérmica.

La pérdida de cabello afecta a millones de personas, incluido más del 40 % de los varones mayores de 30 años de edad y un número significativo de mujeres. Muchas personas buscan remedios en diversos productos farmacéuticos y otros tratamientos, incluidos, por ejemplo, Minoxidil™ de liberación local (Pharmacia) y Propecia™ (Merck) administrado por vía oral. Una solución a la pérdida de cabello es el transplante de folículos pilosos, un procedimiento en el que cabellos de una región del cuero cabelludo que no ha perdido pelo se transplantan a regiones calvas. Los folículos de la región no calva conservan su baja susceptibilidad a los andrógenos incluso en su nueva localización. No obstante, este procedimiento está limitado por el número relativamente pequeño de folículos pilosos que se pueden recoger de la región no calva y “donar” a la región sin cabello. No se puede obtener un patrón completo de cabello con una densidad de folículos equivalente a la típica de, por ejemplo, los adolescentes, usando el transplante de folículos pilosos.

Las células de la papila dérmica (células PD) se pueden extraer de los folículos pilosos (p. ej., derivados de zonas sin calvicie) y transplantar directamente en otro lugar de la piel en el que enseñará a la piel a formar nuevos folículos pilosos (Oliver, R.F., 1967, J. Embr y ol. Exp. Morphol. 18 (1) : 43-51) . Este procedimiento se pudo desarrollar en una terapia alternativa para el restablecimiento de cabello. No obstante, un impedimento para el desarrollo de esta terapia alternativa ha sido que está sujeta a la misma limitación de la disponibilidad de folículos donantes.

Las células PD se pueden expandir en número cuando se cultivan usando condiciones convencionales, pero, en estas condiciones convencionales, pierden rápidamente su capacidad para inducir formación de cabello nuevo (Jahoda, C. &Oliver, R.F., 1981, Sr. J. Dermatol. 105 (6) : 623-7; Messenger, A.G., 1984, Sr. J. Dermatol. 110 (6) : 6859) . Por tanto, hay algo presente in vivo que preserve la capacidad de inducción de cabello que no está en el medio de cultivo celular convencional. Un procedimiento de transplante de cabello que use transplante de células PD no es comercialmente viable sin un procedimiento de cultivo que permita la expansión del número de células sin que pierdan la capacidad de inducción.

Recientemente se han descrito dos procedimientos que pueden soportar la expansión del número celular al tiempo que mantienen el potencial de inducción del cabello de las células PD. En un primer procedimiento se demostró que medio acondicionado (MA) recogido de células epidérmicas de mamífero (queratinocitos) o co-cultivo con queratinocitos soportaba tanto la expansión del número de células PD como el mantenimiento del fenotipo inductor de cabello durante varios pases de cultivos. El primer procedimiento se describe en el documento USP 5, 851, 831 y en J.lnvest. Dermatol.111: 767-75 (1998) .

Un segundo procedimiento describe el cultivo de células de la papila dérmica en presencia de un mayor nivel de la proteína wnt o un agente que imita los efectos de la transducción de señal estimulada por wnt (véase la solicitud de patente internacional nº PCT/US01/1 0164 publicada como documento WO 01/74164 y ishimoto y col., 2002, Genes & Development 14: 1181-85) . En este segundo procedimiento se añade al medio de cultivo una proteína wnt o un fragmento funcional o análogo del mismo como producto purificado o expresando una proteína recombinante en las células productoras y proporcionando la proteína wnt en medio acondicionado mediante el creamiento de células productoras wnt o mediante co-cultivo con las células productoras.

Algunos problemas con los procedimientos conocidos son de una naturaleza práctica y están relacionados con aspectos reguladores, costes de fabricación y problemas técnicos. Para el primer procedimiento, normalmente un fabricante crioconservará un gran número de células para proporcionar un banco de células con propiedades idénticas que se puedan usar en la fabricación. Se tendrá que someter a las células de este banco a pruebas rigurosas de seguridad, incluidas pruebas que detecten agentes infecciosos que potencialmente podrían producir enfermedades en receptores humanos. En última instancia, le banco de células se vaciará y tendrá que volverse a llenar, y el nuevo banco requerirá nuevas pruebas. En el caso de una cepa celular derivada de un tejido primario, tal como queratinocitos de la piel que tienen un ciclo de vida limitada en cultivo, el tamaño del banco celular estará limitado por la capacidad de las células para crecer en cultivo, por lo que los costes asociadas con el uso de dicha fuente tisular serán mayores de lo que serían si se dispusiera de la célula original en un suministro ilimitado. Además, puede haber variaciones entre los donantes de las cepas celulares originales que pueden dar lugar a condiciones de fabricación irreproducibles. El uso de una fuente celular alternativa, tal como las descritas en el presente documento, proporciona una fuente ilimitada de células con propiedades uniformes que sólo se tienen que analizar una vez.

En el segundo procedimiento descrito anteriormente, en el que se usa MC de una célula productora de wnt recombinante para estimular el crecimiento de las células PD se requerían, como mínimo, pruebas similares. No obstante, dado que las células están produciendo proteína recombinante se requieren pruebas de seguridad adicionales. La estabilidad de la expresión del gen wnt en estas células productoras también es un posible problema y puede ser necesario volver a obtener o subclonar las células en el caso de que la expresión del gen wnt se pierda

o reduzca en el tiempo en el cultivo.

La presente invención aborda los problemas asociadas con la técnica anterior permitiendo el cultivo de células inductoras de cabello usando una fuente celular alternativa con propiedades uniformes.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento de cultivo de células de la papila dérmica (PD) y/o células de la vaina dérmica (VD) de una especie de mamífero, en el que el procedimiento comprende las etapas de cultivar y subcultivar las células PD y/o las células VD en un medio de cultivo celular constituido por, o complementado con, un medio acondicionado mediante una o más células epiteliales prostáticas o fibroblastos dérmicos humanos, de modo que las células PD y/o las células VS proliferan al tiempo que conservan su potencial inductor del cabello.

La capacidad de un medio acondicionado mediante células de acondicionamiento derivadas de tejido no epidérmico, tales como células epiteliales prostáticas o fibroblastos dérmicos humanos, para mantener el fenotipo inductor de cabello de las células inductoras de cabello tales como las células de la papila dérmica (PD) y/o células de la vaina dérmica (VD) fue muy inesperada. En contraste con el documento USP 5, 851, 831, en el que los queratinocitos interaccionarían in vivo con las células epidérmicas para formar células pilosas, las células derivadas de tejido no epidérmico usadas en la presente invención no necesariamente se asocian in vivo con las células inductoras de cabello. Por tanto, la presente invención muestra que varias células diferenciadas terminalmente o células progenitoras comprometidas que no son epidérmicas se pueden usar en lugar de queratinocitos para acondicionar el medio para conservar el potencial inductor de cabello de las células inductoras de cabello durante la fase de expansión del cultivo importante en cualquier proceso para producir un gran número de cabellos, por ejemplo a partir de una biopsia pequeña que contiene relativamente pocos folículos.

El tejido puede ser de origen mesodérmico, es decir células epiteliales prostáticas o fibroblastos dérmicos humanos. Un ejemplo de células de acondicionamiento de origen mesodérmico dentro del alcance de la invención son células epiteliales prostáticas, que se muestran en la sección experimental más adelante para ser particularmente eficaces en el mantenimiento de la capacidad inductora de cabello de las células inductoras de cabello en... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de cultivo de células de la papila dérmica (PD) y/o células de la vaina dérmica (VD) de una especie de mamífero, en el que el procedimiento comprende las etapas de cultivar y subcultivar las células PD y/o las células VD en un medio de cultivo celular constituido por, o complementado con, un medio acondicionado mediante una o más células epiteliales prostáticas o fibroblastos dérmicos humanos, de modo que las células PD y/o las células VS proliferan al tiempo que conservan su potencial inductor del cabello.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio acondicionado por una o más células epiteliales prostáticas o fibroblastos dérmicos humanos se obtiene usando una línea celular (por ejemplo, una línea celular establecida) .

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el medio de cultivo carece de vectores virales.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio acondicionado por una o más células epiteliales prostáticas o fibroblastos dérmicos humanos se congela antes de usar.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio acondicionado por una o más células epiteliales prostáticas o fibroblastos dérmicos humanos se genera a partir de células cultivadas en medio sin suero.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el medio acondicionado por una o más células epiteliales prostáticas o fibroblastos dérmicos humanos se concentra (por ejemplo mediante ultrafiltración) antes de usar.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende la etapa de subcultivar las células PD y/o VD en el medio acondicionado por una o más células epiteliales prostáticas o fibroblastos dérmicos humanos para tres o más pases, por ejemplo siete o más pases.

8. El procedimiento acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende la etapa de recolectar o aislar células PD y/o células VD cultivadas o subcultivadas.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células PD y/o células VD son alogénicas con respecto a las células epiteliales prostáticas o a los fibroblastos dérmicos humanos.

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células PD y/o células VD son autólogas con respecto a las células epiteliales prostáticas o a los fibroblastos dérmicos humanos.

11. Un procedimiento de proporcionar y mantener las células de la papila dérmica (PD) y/o las células de la vaina dérmica (VD) para transplante, en el que el procedimiento comprende las etapas de cultivar una célula PD y/o VD obtenida de un sujeto en las condiciones descritas en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

12. Una composición que comprende células PD y/o VS y un medio de cultivo que comprende un medio acondicionado por células epiteliales prostáticas o fibroblastos dérmicos humanos.