CUERPOS DE INCLUSIÓN, CELULAS BACTERIANAS Y COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN Y SUS USOS.

Cuerpos de inclusión, células bacterianas y composiciones que los contienen y sus usos. Campo de la invención La presente invención se refiere a cuerpos de inclusión, a células bacterianas y composiciones que los contienen y a su uso como medicamentos y estimuladores de la proliferación celular y regeneradores de tejido. Antecedentes de la invención Los cuerpos de inclusión bacterianos (IBs) son depósitos de proteínas altamente puros producidos en bacterias recombinantes 1 . Siendo insolubles en agua, se observan como partículas amorfas porosas y altamente hidratadas en el rango de tamaño de varios cientos de nanómetros. Las cadenas polipeptídicas que forman los IBs se pliegan en una estructura molecular de tipo amiloide compatible con su estructura nativa, manteniendo de este modo las actividades biológicas de los polipéptidos incluidos (por ejemplo, fluorescencia o actividad enzimática). Por lo tanto, tras la debida manipulación de los mismos, surge un amplio espectro de usos potenciales de los IBs como materiales funcionales y biocompatibles. Aunque teóricamente viable mediante el ajuste de condiciones genéticas y de producción, nunca se han manipulado las características biofísicas de estas partículas proteináceas, tales como la actividad y el tamaño. En este estudio, se caracterizan las propiedades a nanoescala de IBs como nuevos materiales particulados y se explora en qué grado las partículas producidas se pueden diseñar mediante estrategias simples. Además, como prueba de concepto destacada, se han obtenido superficies modificadas con cuerpos de inclusión que estimulan de manera significativa la proliferación de células de mamífero, demostrando el potencial de los IBs en la manipulación de tejidos y la medicina regenerativa entre otras aplicaciones biomédicas prometedoras. Muchos polipéptidos recombinantes producidos en bacterias modificadas genéticamente agregan como IBs. Estos depósitos de proteínas aparecen como partículas altamente hidratadas que se encuentran en el citoplasma bacteriano 2 o, en algunos casos, en el periplasma 3 . Los IBs son químicamente puros, ya que la propia proteína recombinante es el componente principal - hasta alrededor de un 95% de la proteína total - 2,4,5 . Otras moléculas celulares, tales como ARN, ADN y lípidos resultan atrapados durante la formación de IB y están presentes en cantidades menores 6 . La formación de IBs es un proceso rápido y eficaz, tal como se observa después de unos minutos de la inducción de la expresión génica. Varias horas más tarde, pueden representar fácilmente alrededor del 50% de la biomasa celular total 5 . Aunque en el pasado se creía que los IBs estaban formados por cadenas polipeptídicas no plegadas o ampliamente mal plegadas y, por lo tanto, biológicamente inertes, recientes observaciones, presentan estas partículas como constituidas por especies de proteínas que se pliegan correctamente y que, por tanto, son biofuncionales 8 . La estructura molecular de IBs se basa en una organización particular de tipo amiloide 9,10 que permite interacciones de lámina beta cruzada que coexisten con dominios de proteínas correctamente plegadas 11 . Por lo tanto, los IBs formados por enzimas pueden ser catalizadores útiles en diferentes tipos de bioprocesos tal como se ha observado recientemente para la ß-galactosidasa, D-aminoácido oxidasa, maltodextrina fosforilasa, ácido siálico aldolasa y polifosfato quinasa 1115 , entre otras. Por otro lado, su formación in vivo, que implica la deposición de proteínas dependiente de la secuencia alrededor de centros de nucleación, está regulada por varios genes celulares (que codifican principalmente proteasas y chaperones que actúan como una red funcional, lo que permite la manipulación de sus propiedades a nanoescala) 16,17 . En la presente invención se determinan las características más relevantes de IB como nanopartículas y prueba que pueden diseñarse mediante una manipulación genética y del proceso apropiada de las bacterias productoras. Al ser materiales totalmente biocompatibles y mecánicamente estables, se ha utilizado además los IBs como nanopartículas para modificar la rugosidad de las superficies para la estimulación de la proliferación de células de mamífero. Dado que esencialmente cualquier especie de proteína se puede producir como IBs bacterianos y sus propiedades a nanoescala se pueden ajustar fácilmente, las posibilidades funcionales de estos materiales novedosos ofrecen un espectro inusual de aplicaciones biomédicas adicionales aparte de las mostradas aquí en el contexto de la manipulación de tejidos. Descripción resumida de la invención La presente invención se refiere a cuerpos de inclusión, a células bacterianas y composiciones que los contienen y a su uso como estimuladores de la proliferación celular y regeneradores de tejido. Un primer objeto de la presente invención se refiere a un cuerpo de inclusión aislado que comprende un polipéptido caracterizado porque el cuerpo de inclusión está en forma particulada. Un segundo objeto de la presente invención se refiere a una célula bacteriana que comprende el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales. Un tercer objeto de la presente invención se refiere a una composición que comprende el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales y una célula eucariota. Un cuarto objeto de la presente invención se refiere a una composición que comprende el cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales y un tejido de animal o planta. 2 ES 2 352 489 A1 Un quinto objeto de la presente invención se refiere a los usos del cuerpo de inclusión según el primer objeto de la invención y sus diferentes aspectos estructurales y de disposición, como medicamentos y estimuladores de la proliferación celular y regeneradores de tejido. Breve descripción de los dibujos Figura 1. Caracterización morfológica y funcional de IBs. A. Imágenes de microscopía confocal de células bacterianas salvajes que producen IBs formados por una proteína GFP de fusión. De arriba abajo, muestras de células tomadas a 1 hora, 2 horas y 3 horas después de la inducción de la producción de IB. B. Imágenes de microscopía confocal utilizando una paleta Metamorf de células bacterianas salvajes, IbpAB , ClpA , ClpP y DnaK que producen IBs formados por una GFP de fusión de 2 horas de formación (parte superior). Imágenes de microscopía confocal de IBs de 3 horas de formación purificados de estas cepas (parte inferior). Las barras en A y B indican 1 µm. C. Curvas de distribución del tamaño de partícula medidas mediante dispersión de luz dinámica de IBs de 3 horas de formación producidos por diferentes cepas bacterianas. Los IBs de células deficientes en IbpAB se excluyeron de este estudio debido a su particular tendencia por agregarse como complejos supraparticulados (resultados no mostrados). Las curvas se representan en términos del porcentaje en volumen de partícula. Las distribuciones del tamaño volumétrico de partícula se describen mediante D[v,0,5], que es el diámetro de partícula (nm) por debajo del cual existe un 50% del volumen total del sistema. D[v,0,5] es el diámetro medio de partícula en volumen (nm). El índice de polidispersidad (PdI) se define como [D(v, 0,1)/D(v,0,9)] · 100. D. Fluorescencia emitida por IBS analizada mediante citometría de flujo, para partículas purificadas de las cepas de E. coli IbpAB , ClpA , ClpP y DnaK . Figura 2. Estructura fina y estabilidad de IBs con GFP. En las imágenes superiores, caracterización por AFM de IBs formados por una GFP de fusión, de 3 horas de formación. A. Imagen topográfica de 2,5 x 2,5 µm de IBs depositados sobre la superficie de forma aleatoria. B. Imagen tridimensional de 600 x 600 nm que muestra dos IBs de la imagen del panel A. C. Sección transversal topográfica de una partícula de IB aislada (indicada como una línea azul en A), que indica la existencia de una cierta rugosidad RMS intrínseca en la superficie de IB de 1,89 nm, como consecuencia de la estructura interna que da lugar a una textura de superficie fina. En D, las imágenes SEM de IBs de 3 horas de formación producidos en células salvajes (parte superior) y en células DnaK (parte inferior). Las barras blancas indican 500 nm. En E, se muestran las estabilidades de IBs en tampón acuoso a 37ºC, 25ºC y 4ºC, o liofilizados (L) y guardados posteriormente a 25ºC ó 4ºC. F. Imágenes de microscopía confocal de IBs purificados mantenidos en tampón durante un mes a 25ºC, 4ºC y -80ºC, y después de liofilización/reconstitución (L). Figura 3. Proliferación de células de mamífero estimuladas por IB. Imagen confocal de una placa de poliestireno de 35 mm recubierta... [Seguir leyendo]

1. Cuerpo de inclusión aislado que comprende un polipéptido caracterizado porque el cuerpo de inclusión está en forma particulada. 2. Cuerpo de inclusión aislado según la reivindicación 1, en el que la forma particulada tiene un tamaño de partícula entre 24 y 1500 nm. 3. Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la partícula está en forma amorfa hidratada. 4. Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el polipéptido es un polipéptido quimérico que comprende una proteína viral fusionada de manera traduccional con una proteína informadora. 5. Cuerpo de inclusión aislado según la reivindicación 4, en el que la proteína viral es una proteína de la cápside. 6. Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en el que la proteína informadora es una proteína fluorescente. 7. Composición que comprende el cuerpo de inclusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y una célula eucariota. 8. Composición según la reivindicación 7, en la que la célula eucariota es una célula de mamífero. 9. Composición que comprende el cuerpo de inclusión según cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un tejido de animal o planta. 10. Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el cuerpo de inclusión se deposita sobre una placa tratada con cultivo de tejido. 11. Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el cuerpo de inclusión se deposita sobre un sustrato de silicio. 12. Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el cuerpo de inclusión se incorpora dentro de un andamiaje tridimensional de tipo sintético o natural. 13. Uso del cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 10-12, como estimulador de la proliferación de células eucariotas. 14. Uso del cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 10-12, como regenerador de tejido. 15. Cuerpo de inclusión aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 10-12, para su uso como medicamento. 16. Célula bacteriana que comprende el cuerpo de inclusión tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6. 17. Célula bacteriana según la reivindicación 16, en la que la célula bacteriana es Escherichia Coli. 18. Célula bacteriana según la reivindicación 17, en la que E. coli se selecciona entre E. coli de cepa salvaje o una cepa mutante. ES 2 352 489 A1 11 ES 2 352 489 A1 12 ES 2 352 489 A1 13 ES 2 352 489 A1 14 ES 2 352 489 A1 ES 2 352 489 A1 16 ES 2 352 489 A1 17 ES 2 352 489 A1 18 ES 2 352 489 A1 19 ES 2 352 489 A1 ES 2 352 489 A1 21 ES 2 352 489 A1 22 ES 2 352 489 A1 23 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA