CUANTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS.

La invención se relaciona con un nuevo método para determinar la cantidad de un anticuerpo interés en una muestra biológica. En una modalidad, el método de la invención se caracteriza porque comprende al menos una etapa de reducción de la proteína de dicha muestra biológica por medio de ingestión con pepsina para producir fragmentos F(ab)2. En una modalidad preferida, uno o más péptidos que identifican la secuencia del anticuerpo de interés se controlan utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento con detección por medio de espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS). Antecedentes de la invención La habilidad para determinar en forma precisa y confiable las farmacocinéticas de compuestos farmacéuticos en una variedad de modelos preclínicos y de muestras clínicas es esencial para diseñar regímenes de dosificación para una eficacia óptima y una toxicidad mínima. Esto maximiza las posibilidades de éxito en la última etapa de los ensayos clínicos y es un componente necesario en el proceso regulatorio de aprobación. Debido a su alta probabilidad de éxito y reducidos períodos/costos de desarrollo, se están volviendo muy importantes los anticuerpos terapéuticos monoclonales (mAb) para la industria farmacéutica. Estas proteínas son inmunoglobulinas (lgG) que actúan por 15 medio del enlazamiento del objetivo e inhibiendo su actividad/reduciendo su concentración. El control de las concentraciones de mAb en suero comúnmente se lleva a cabo por medio de la utilización de ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA). Esta técnica es sensible (los LOQ son tan bajos como picogramos/mL) y lo suficientemente rápida para analizar miles de muestras. Sin embargo, tiene limitaciones significativas que incluyen una pobre precisión (CV hasta del 30%) y exactitud. Además, puede estar sujeto a interferencias de la 20 matriz tales como anticuerpos antifármaco y tiene un largo tiempo de desarrollo. Además, cuando se cambia entre modelos preclínicos, de muestras preclínicas a clínicas o deshumanización del anticuerpo para reducir efectos toxicológicos en el modelo preclínico, el ensayo necesita a menudo ser reconstruido. En consecuencia, sería útil desarrollar otros métodos para mejorar la confiabilidad de los datos y reducir los períodos/gastos de desarrollo.   La cromatografía líquida de alto rendimiento con detección por espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) es un método ampliamente utilizado para cuantificar compuestos farmacéuticos de molécula pequeña a partir de la crisis biológicas. Un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo que opera en modo de control de reacción múltiple (MRM) proporciona típicamente los LOQ más bajos, la especificidad más alta, la mejor precisión y exactitud y el rendimiento más alto, aunque también pueden ser empleados otros tipos de métodos de espectrometría de masas. Únicamente recientemente se ha extendido esta tecnología la cuantificación de proteínas de muestras complejas tales como suero y lisados celulares (Gerber et al. (2003)). Esta tecnología es también descrita para la detección de conjugados anticuerpo-fármaco en la solicitud de patente PCT WO 2005/101017 (2005, Genetech). Para esta solicitud, se digiere generalmente la muestra con tripsina y se controlan los péptidos proteotípicos con HPLC-MS/MS y se utilizan para calcular la concentración de proteína. Las técnicas de preparación de las muestras para este análisis implican típicamente la reducción de las proteínas más abundantes con los LOQ en el rango de 1 - 5 µg/mL (Anderson y Hunter (2006)). La reducción se logra con columnas de inmunoafinidad o colorantes y tiene limitaciones significativas con respecto al costo, la capacidad y el rendimiento total del suero. Además, los kits de reducción pueden tener efectividad reducida para diferentes especies. Además, con los mAb, el único tipo de reducción factible a partir de fuentes comercialmente disponibles es albúmina. El enriquecimiento de los IgG puede ser posible utilizando columnas o perlas de Proteína A/G, sin embargo, esta estrategia también sufre de limitaciones similares. La pepsina es una proteasa relativamente no específica que ha sido utilizada por muchos grupos para producir fragmentos de anticuerpos que retienen la habilidad para enlazar antígeno (F(ab)2) de IgG (Rousseaux et al. (1980)). Recientemente, Jones y Landon (2002 y 2003) demostraron que se puede utilizar pepsina para la producción comercial de las F(ab)2 a partir de muestras de suero ovino. La producción de F(ab)2 a partir de suero entero por medio de digestión con pepsina ha sido mostrada por Boushaba Rihab et al. Las velocidades de producción han sido medidas, pero no se ha determinado la concentración inicial de anticuerpo ("Kinetics of whole serum and prepurified IgG digestion by pepsin for F(ab)2 manufacture*. Biotechnology Progress; vol. 19, no.4, July 2003, páginas 1176 - 1182). La presente invención se deriva de la primera demostración de que enzimas como la pepsina pueden ser utilizadas para agotar el suero y enriquecerlo con F(ab)2 como primera etapa en el ensayo para cuantificación de los mAb del suero, por ejemplo, un ensayo basado en espectrometría de masas. Este enfoque es económico, universal (independientemente de la especie y del mAb de interés) y tiene capacidad ilimitada. Además, agota los péptidos asociados con la región Fc de las IgG. Estos péptidos son los más altamente conservados y los más abundantes. La remoción de estos reduce la supresión de iones por MS y disminuye el LLOQ. Descripción detallada de la invención La presente invención se relaciona con un método in vitro para determinar la cantidad de un anticuerpo de interés en una muestra biológica, dicha muestra biológica comprendiendo además proteínas diferentes a los anticuerpos, caracterizado porque dicho método comprende las etapas de: 2 E07865898 26-12-2011   a) incubar la muestra biológica con una proteasa como la pepsina bajo condiciones apropiadas para proteólisis de las proteínas que no son de inmunoglobulina y la digestión de las moléculas de anticuerpo para producir fragmentos de anticuerpo que contienen al menos una región CDR; y, b) determinar la cantidad de los fragmentos de anticuerpo derivados del anticuerpo de interés; dicha cantidad de fragmentos de anticuerpo correlacionada con la cantidad de anticuerpo de interés en la muestra biológica. A menos que se establezca otra cosa, se utilizan aquí los siguientes términos y frases para que tengan el siguiente significado: El término "anticuerpo", como se utiliza aquí, se refiere a la longitud completa o a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la habilidad para enlazarse específicamente con un antígeno. Se ha demostrado que la función de enlazamiento con el antígeno de un anticuerpo puede ser llevada a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa, los "fragmentos de enlazamiento". Los ejemplos de fragmentos de enlazamiento incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que contienen los fragmentos Fab engrasados por medio de un puente de disulfuro en la región de bisagra; un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward et al., 1989), que consiste de un dominio VH; y una región aislada determinante de complementariedad (CDR). Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por medio de un enlazador sintético que les permite a ellos ser elaborados como una sola cadena de proteína en la cual se aparean las regiones VL y VH para formar moléculas monovalentes (conocida como cadena individual Fv (scFv); ver por ejemplo, Huston et al., 1988). Tales anticuerpos de una sola cadena también están abarcados dentro del término "porción de enlazamiento del antígeno" de un anticuerpo. El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza aquí, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad única de enlazamiento para un epítopo particular. El término "péptido de interés" se refiere preferiblemente a un péptido comprendido en los fragmentos de anticuerpo generados por digestión como la de la pepsina que muestra propiedades cromatográficas y espectrométricas de masas experimentalmente ventajosas. En una modalidad, el péptido de interés o una combinación de péptidos de interés es única, es decir, puede ser encontrada únicamente en el anticuerpo de interés. Un desempeño cromatográfico ventajoso se define como picos estrechos con alta recuperación... [Seguir leyendo]

1. En un método in vitro para determinar la cantidad de un anticuerpo de interés incluido en una muestra biológica, dicha muestra biológica incluye además proteínas diferentes a los anticuerpos, caracterizado porque dicho método comprende las etapas de: a) incubar la muestra biológica con una proteasa capaz de digerir las proteínas que no son de inmunoglobulina, pro que retienen al menos la región variable de los anticuerpos bajo condiciones apropiadas para la proteólisis de las proteínas que no son de inmunoglobulina y la digestión de las moléculas de anticuerpo para producir fragmentos de anticuerpo que contienen al menos una región CDR; y, b) determinar la cantidad de los fragmentos de anticuerpo derivados del anticuerpo de interés; dicha cantidad de fragmentos de anticuerpo correlacionada con la cantidad de anticuerpo de interés en la muestra biológica. 2. El método de la Reivindicación 1, en donde dicha proteasa en la etapa a) se selecciona de entre el grupo de proteasas capaces de producir fragmentos Fab o F(ab)2. 3. El método de la Reivindicación 2, en donde dicha proteasa en la etapa a) es pepsina o un homólogo adecuado capaz de producir fragmentos estables de F(ab)2. 4. El método de la Reivindicación 1, 2 o 3, en donde la etapa b) comprende las siguientes subetapas de: b1) adición de uno o más péptidos como estándar interno a los fragmentos de anticuerpo generados en la etapa a), después de la desactivación de la pepsina; b2) digestión de la muestra de la etapa b1) con otra proteasa capaz de digerir proteínas que no son de inmunoglobulina, sin ser capaz de retener al menos la región variable de los anticuerpos, y opcionalmente, extraer los péptidos de la muestra; b3) separar parcialmente entre sí los péptidos extraídos en una o más muestras; b4) medir por medio de espectrometría de masas la masa o la relación de masa a carga de los péptidos de la muestra, junto con iones del fragmento seleccionado de la misma, presentes en una o más de las muestras separadas e identificar las señales de pico correspondientes a uno o más péptidos de interés del anticuerpo de interés así como los péptidos que sirven como estándar interno; y, b5) determinar la cantidad de los péptidos de interés en la muestra, determinando así la cantidad del anticuerpo interés incluida en la muestra biológica. 5. El método de la Reivindicación 4, en donde la etapa b5) consiste de la comparación de dichas señales de pico con respecto a las señales de pico derivadas de una curva estándar de anticuerpo añadido en diferentes concentraciones conocidas dentro del material fuente biológico que sirve como blanco utilizando los péptidos que sirven como estándar interno para normalización de la señal para determinar la cantidad de los péptidos de interés en la muestra, determinando así la cantidad del anticuerpo interés contenida en la muestra biológica. 6. El método de la Reivindicación 4 o 5, en donde la etapa de separación b3) se lleva a cabo por medio de la separación de los péptidos de la muestra por medio de separación cromatográfica. 7. El método de la Reivindicación 4, 5 o 6, en donde la etapa b4) de análisis por espectrometría de masas se lleva a cabo por medio de espectrometría de masas en tándem (MS/MS). 8. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 4 - 7, en donde dichos péptidos que sirven como estándar interno son péptidos marcados en forma isotópica. 9. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 4 a 8, en donde dichos péptidos de interés incluyen al menos una porción seleccionada en la región variable del anticuerpo de interés, apropiada para discriminar entre las señales de pico correspondientes específicamente a los fragmentos del anticuerpo de interés y la señal no especifica correspondiente a otros fragmentos de proteína. 10. El método de la Reivindicación 9, en donde dichos péptidos de interés incluyen al menos una porción seleccionada entre aquellas que incluyen residuos aminoácidos únicos en las regiones de cadena liviana variable y/o de cadena pesada del anticuerpo cuando se compara con los correspondientes residuos aminoácidos de las IgG nativas obtenidos a partir de una base de datos de secuencia de las IgG nativas. 11. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 4 - 10, en donde dicho análisis por espectroscopia de masas se lleva a cabo utilizando un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple. 12. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 - 11, en donde dicha muestra biológica es un suero, plasma, tejido o línea de células derivada de cualquier especie. 12 E07865898 26-12-2011   13. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 - 12, en donde el anticuerpo de interés es un anticuerpo de origen no natural que se administra a un mamífero. 14. El método de la Reivindicación 13, en donde dicho anticuerpo de interés es un producto terapéutico potencial. 15. El método de cualquiera de las Reivindicaciones 1 - 14, en donde dicho no tiene ninguna etapa de enriquecimiento de anticuerpo por medio de columnas de afinidad o de agotamiento de albúmina. 13 E07865898 26-12-2011   14 E07865898 26-12-2011   E07865898 26-12-2011   16 E07865898 26-12-2011   17 E07865898 26-12-2011