Un método para realizar una prueba genética de un feto que comprende el aislamiento,

mediante elfraccionamiento de tamaño, una muestra de ácido nucleico a partir de una muestra de moco cervical obtenida apartir de un sujeto femenino que contiene el feto, la muestra de ácido nucleico que consiste esencialmente depolinucleótidos en un tamaño que varía de aproximadamente 50 pares de base a aproximadamente 300 pares debase, y en donde el resultado de una prueba genética en la muestra de ácido nucleico, es indicativo de unacomposición genética del feto.

Cribado genético prenatal no-invasivo

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general al aislamiento del ácido nucleico fetal y cribado prenatal o prueba de anomalías genéticas y cromosómicas.

Antecedentes de la invención

Por lo general, el cribado o prueba prenatal se realiza para determinar el género del feto o para detectar trastornos genéticos y/o anomalías cromosómicas en el feto durante el embarazo. Al día de hoy, se han reconocido más de 4000 trastornos genéticos, causados por uno o más genes defectuosos. Algunos ejemplos incluyen Fibrosis Quística, Enfermedad de Huntington, Talasanemia Beta, Distrofia Miotónica, Anemia de Células Falciformes, Porfiria, y Síndrome del X Frágil. La anomalía cromosómica se causa por aberraciones en el número de cromosomas, duplicación o ausencia del material cromosómico, y por defectos en la estructura del cromosoma. Algunos ejemplos de anomalías cromosómicas son las trisomías, a saber la trisomía 16, una de las causas principales de aborto involuntario en el primer trimestre, la trisomía 21 (síndrome de Down) , la trisomía 13 (síndrome de Patau) , trisomía 18 (síndrome de Edwards) , síndrome de Klinefelter (47, XXY) , (47, XYY) , y (47, XXX) ; la ausencia de cromosomas (monosomía) , por ejemplo, síndrome de Turner (45, X0) ; translocaciones cromosómicas, deleciones y/o microdeleciones, por ejemplo, Translocación Robertsoniana, síndrome de Angelman, síndrome de DiGeorge y síndrome de Wolf-Hirschhorn.

Las pruebas genéticas prenatales disponibles actualmente suelen incluir procedimientos invasivos. Por ejemplo, muestreo de vellosidades coriónicas (CVS) realizado en una mujer embarazada en torno a las 10-12 semanas de embarazo y la amniocentesis realizada en torno a las 14-16 semanas, todas incluyen procedimientos invasivos para obtener la muestra para la prueba de anomalías cromosómicas en un feto. Las células fetales obtenidas a través de estos procedimientos de muestreo, generalmente se examinan para detectar anomalías cromosómicas utilizando análisis citogenéticos o de hibridación fluorescente in situ (FISH) .

Mientras que estos procedimientos pueden ser útiles para la detección de aberraciones cromosómicas, se ha demostrado que se asocian con el riesgo de aborto involuntario. Por consiguiente, la amniocentesis o CVS solo se ofrece a las mujeres que se consideran en un riesgo mayor, incluyendo aquellas de edad maternal avanzada (>35 años) , aquellas con cribado de suero maternal anormal o aquellas que han tenido una previa anomalía cromosómica fetal. Como resultado de estas pruebas, el porcentaje de mujeres mayores de 35 años que dieron luz a bebes con aberraciones cromosómicas tales como síndrome de Down ha disminuido drásticamente. Sin embargo, la falta del cribado o pruebas prenatales apropiadas o relativamente seguras, para la mayoría de mujeres embarazadas se ha traducido en cerca del 80% de bebes con síndrome de Down que nacen de mujeres por debajo de los 35 años de edad.

De esta manera, existe una necesidad de pruebas de cribado de diagnóstico para la población general de mujeres embarazadas, especialmente las pruebas dirigidas a identificar aberraciones cromosómicas fetales, así como otros defectos o variaciones genéticas.

Li et al (Clinical Chemistr y (2004) 50 (6) :1002-1011) describe el análisis de ADN fetal en plasma maternal.

Adinolfi and Sherlock (Human Reproduction Update (1997) 3 (4) :383-392) revelan que las células trofoblásticas humanas se pueden recuperar mediante procedimientos mínimamente invasivos a partir del canal endocervical entre 6 y 15 semanas de gestación, y que la incidencia con las que las células fetales se pueden detectar en muestras de células transcervicales (TCC) varía de acuerdo con el método de recolección y las técnicas moleculares empleadas para su identificación.

WO98/54364 describe métodos no-invasivos para detectar la presencia de secuencias de ácido nucleico específicas mediante el análisis de muestras de orina para la presencia de ácidos nucleicos que han cruzado la barrera del riñón, incluyendo los métodos para detectar secuencias de ácido nucleico fetal específicas mediante el análisis de orina materna para la presencia de ácidos nucleicos fetales.

Resumen de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la mucosa cervical es un buen depósito natural para células de la placenta que migraron, por ejemplo, células fetales así como para el aislamiento de ácidos nucleicos fetales. En consecuencia, la presente divulgación provee los métodos y kits útiles para la prueba o el cribado de anomalías genéticas en fetos, utilizando ácidos nucleicos fetales aislados a partir de muestras de moco

cervical. Además, la presente divulgación provee cebadores y sondas útiles para la amplificación del ácido nucleico de, por ejemplo, marcadores genéticos, especialmente utilizando amplicones de tamaño relativamente pequeño en el cribado genético fetal.

En una modalidad de la invención, se provee un método para conducir una prueba genética de un feto. El método comprende el aislamiento, mediante el fraccionamiento de tamaño, una muestra de ácido nucleico a partir de una muestra de moco cervical obtenida de un sujeto femenino que contiene el feto, en donde la muestra de ácido nucleico consiste esencialmente de polinucleótidos en un tamaño que varía de aproximadamente 50 pares de base a aproximadamente 300 pares de base y en donde el resultado de una prueba genética en la muestra de ácido nucleico es indicativo de una composición genética del feto.

En otra modalidad de la invención, se provee un método del aislamiento de una muestra de ácido nucleico fetal. El método comprende el aislamiento, mediante el fraccionamiento de tamaño, una muestra de ácido nucleico que consiste esencialmente de polinucleótidos de aproximadamente 50 pares de base a aproximadamente 300 pares de base en longitud de una muestra de moco cervical obtenida de un sujeto femenino que contiene el feto.

También se revela un kit de prueba genética apropiado, para la prueba de la composición genética de un feto. El kit comprende un par de cebadores apropiado, para amplificar un alelo deseado o marcador genético, en donde el fragmento amplificado del nucleótido es menos de aproximadamente 200 pares de base y en donde el alelo deseado no se asocia únicamente con el cromosoma Y. En otras modalidades, el kit comprende una muestra aislada de ADN a partir de una muestra de moco cervical obtenida de un sujeto femenino que contiene el feto. La muestra de ADN consiste esencialmente de polinucleótidos en un tamaño que varía de aproximadamente 50 pares de base a aproximadamente 200 pares de base.

También se revela una muestra aislada de ADN útil para pruebas genéticas de un feto. La muestra de ADN se puede obtener, mediante el aislamiento de fragmentos de ADN en un tamaño que varía de aproximadamente 50 pares de base a aproximadamente 200 pares de base a partir de una muestra de moco cervical obtenida de un sujeto femenino que contiene el feto.

Breve descripción de las figuras

FIG. 1 muestra el fraccionamiento de tamaño de ADN total obtenido de moco cervical en un gel de poliacrilamida al 10%. La "Banda A, " correspondiente a una longitud de polinucleótido de aproximadamente 50-200 pares de base contiene ADN fetal.

FIG. 2 muestra un ejemplo de electroferograma de PCR demostrando que en un experimento las señales fetales corresponden entre el ADN de tejido fetal y el fragmento de 50-200 bp de ADN aislado de una muestra de moco cervical.

FIG. 3 muestra otro ejemplo de electroferograma de PCR demostrando que en otro experimento las señales fetales corresponden entre el ADN de tejido fetal y el fragmento de 50-200 bp de ADN aislado de una muestra de moco cervical.

Descripción detallada de la invención

El descubrimiento de la presente invención es que las muestras de moco cervical pueden ser una gran fuente de células fetales así como de ácidos nucleicos fetales. En consecuencia, la presente divulgación provee métodos, reactivos y kits útiles para la prueba o el cribado de anomalías genéticas del feto, utilizando ácidos nucleicos aislados a partir de muestras de moco cervical.

Además, la presente divulgación provee los cebadores y sondas útiles para la... [Seguir leyendo]

1. Un método para realizar una prueba genética de un feto que comprende el aislamiento, mediante el fraccionamiento de tamaño, una muestra de ácido nucleico a partir de una muestra de moco cervical obtenida a partir de un sujeto femenino que contiene el feto, la muestra de ácido nucleico que consiste esencialmente de polinucleótidos en un tamaño que varía de aproximadamente 50 pares de base a aproximadamente 300 pares de base, y en donde el resultado de una prueba genética en la muestra de ácido nucleico, es indicativo de una composición genética del feto.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra de moco cervical se obtiene mediante hisopos transcervicales, un lavado endocervical, un citocepillo, una aspiración, un lavado intrauterino, o una combinación de estos.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra de ácido nucleico es una muestra de ADN o una muestra de ARN.

4. El método de la reivindicación 1, que además comprende el uso de la muestra aislada de ácido nucleico para la prueba de una composición genética que no se asocia únicamente con el cromosoma Y, en donde la composición genética de la muestra aislada de ácido nucleico es indicativa de la composición genética del feto.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la composición genética se selecciona del grupo que consiste de trisomía, trisomía parcial, duplicación cromosómica, monosomía, monosomía parcial, deleción cromosómica, translocación cromosómica, e inversión cromosómica.

6. El método de la reivindicación 4, en donde la composición genética es indicativa de un condición patológica seleccionada del grupo que consiste de Síndrome de Down, Síndrome de Edwards, Síndrome de Patau, Síndrome del X Frágil, Síndrome de Turner, Síndrome de Klinefelter, Síndrome de Triple X, Síndrome XYY, Trisomía 8, Trisomía 16, Síndrome de Wolf-Hirschhorn, y Síndrome de RhD.

7. El método de la reivindicación 1, que además comprende el uso de la muestra aislada de ácido nucleico como una plantilla para una prueba genética utilizando una tecnología de ensayo seleccionada del grupo que consiste de PCR, PCR en tiempo real, LCR, Q-B-replicasa, SDA, RCA, TMA, LADA, MDA, y la tecnología invasora.

8. El método de la reivindicación 1, que además comprende el uso de la muestra aislada de ácido nucleico para la prueba de la presencia de un marcador genético o un alelo en el feto, en donde la presencia del marcador genético o alelo se basa en la amplificación de un fragmento de nucleótido utilizando un par de cebadores específicos para el marcador genético o alelo.

9. El método de la reivindicación 8, en donde el alelo corresponde a una condición genética seleccionada del grupo que consiste de anemia de célula falciforme, Fenilcetonuria, enfermedad de Tay-Sachs, Fibrosis Quística, beta-Talasemia, Hiperplasia Suprarrenal, Anemia de Fanconi, Atrofia Muscular Espinal, Distrofia Muscular de Duchenne, Enfermedad de Huntington, Distrofia Miotónica, Translocación Robertsoniana, Síndrome de Angelman, Síndrome de DiGeorge, Esclerosis Tuberosa, Ataxia Telangieltasia, y Síndrome de Prader-Willi.

10. El método de la reivindicación 8, en donde el par de cebadores se selecciona del grupo que consiste de cebadores de SEQ ID NOs:17 y 18, SEQ ID NOs: 15 y 16, SEQ ID NOs: 19 y 20, SEQ ID NOs: 21 y 22, SEQ ID NOs: 1 y 2; SEQ ID NOs: 3 y 4; SEQ ID NOs: 5 y 6; SEQ ID NOs: 9 y 10; SEQ ID NOs: 11 y 12; SEQ ID NOs: y 14, y un conjunto de cebadores enumerado en las Tablas 2, 3, 4 o 5.

11. Un método del aislamiento de una muestra de ácido nucleico fetal que comprende: el aislamiento, mediante el fraccionamiento de tamaño, una muestra de ácido nucleico que consiste esencialmente de polinucleótidos de aproximadamente 50 pares de base a aproximadamente 300 pares de base en longitud a partir de una muestra de moco cervical obtenida de un sujeto femenino que contiene el feto.