Control de desnaturalización de proteínas.

Un procedimiento para supervisar el grado de desnaturalización y agregación de proteínas durante el transcursode un procedimiento de tratamiento por calor que comprende las etapas de:

calentar un fluido que contiene proteína acuosa a una temperatura correspondiente a una intensidad detratamiento por calor próxima a una intensidad de tratamiento por calor esperada previamente establecida;recoger una muestra de la solución proteica calentada;

diluir dicha muestra o muestras en un tampón formulado de modo que:

el pH en dicha muestra esté sustancialmente sin cambios,

las condiciones iónicas en dicha muestra estén sustancialmente sin cambios, y

la viscosidad de dicha muestra se mantenga al menos sustancialmente, todo en relación con lamuestra no diluida,

medir la turbidez de dicha muestra en relación con una muestra de control no tratada;

comparar la medición de turbidez obtenida con los límites de medición de turbidez previamenteestablecidos correspondientes a un intervalo de tamaño de agregados proteicos medios deseado;recoger una muestra de la solución proteica calentada;

mezclar dicha muestra o muestras con un sistema de medición de reacción de grupo -SH químico;y

comparar la medición del grupo SH obtenido con límites de medición de grupos SH previamenteestablecidos correspondientes a un grado deseado de desnaturalización.

Control de desnaturalización de proteínas

La presente invención se refiere al tratamiento por calor de soluciones proteicas, y, más particularmente a el control del grado de desnaturalización y tamaño de partículas de las soluciones proteicas calentadas.

El tratamiento por calor de soluciones proteicas globulares, tales como clara de huevo, proteínas de la soja y el suero está relativamente extendido en la industria alimentaria, y se ha usado para una diversidad de fines a lo largo de los años. Dicho tratamiento implica generalmente tratamiento por calor más o menos extenso, que con frecuencia da como resultado desnaturalización completa de las moléculas proteicas, dando como resultado de la agregación extensa de las proteínas la formación de grandes agregados en el caso de soluciones más diluidas y gelificación en el caso de soluciones más concentradas. De hecho, diversos procedimientos para la preparación de agregados de proteínas del suero de suero dulce y ácido con tamaños que varían de 0, 1 a 10 μm han sido el objeto de muchas solicitudes de patente en los últimos 10 años. Puede encontrarse un sumario de diversos procedimientos de la técnica anterior en la patente de Estados Unidos Nº 6.767.575. Se analiza la importancia de diversas variables diferentes tales como temperatura de calentamiento, tiempos de mantenimiento, valores de pH y diferentes procedimientos de calentamiento. Ninguna de estas divulgaciones anteriores describe la preparación de agregados de proteínas del suero a partir de una solución de proteínas del suero que tenga una concentración proteica >15% en peso de agua, es decir una concentración proteica de más de 15 g por 100 g de solución. El tratamiento por calor de suero líquido a concentraciones proteicas >15% presenta un problema particular puesto que con frecuencia conduce a gelificación incontrolada. Por otro lado, la dilución del suero líquido a concentraciones proteicas <15% requiere evaporación después de desnaturalización por calor a 15-28% de proteína (correspondiente a 25-30% de sólidos totales (TS) ) , para permitir un secado por pulverización económico, que aumenta considerablemente los costes de procesamiento.

En general, el control de la desnaturalización no ha sido muy eficaz debido a la falta de procedimientos adecuados para supervisar el grado de desnaturalización durante el procesamiento comercial y el entendimiento un tanto limitado de los diversos procedimientos implicados en la desnaturalización inducida por calor de proteínas globulares, y en particular la importancia de la formación inicial (incluyendo exposición) de grupos -SH reactivos y la reacción de estos en procedimientos de agregación posteriores.

La patente de Estados Unidos Nº 6.767.575 expone que “El control del procedimiento de la invención conseguido estableciendo el grado de desnaturalización representa la diferencia significativa entre el procedimiento de la invención y los procedimientos conocidos por los expertos en la materia”. Y además: “Si la desnaturalización por calor no se lleva a cabo de una manera controlada, incluso variaciones muy pequeñas de la composición de los materiales de partida, por ejemplo diferentes contenidos de las fracciones proteicas presentes en la solución de partida, por ejemplo leche o suero, en el pH de la solución de partida y similares significan que el contenido deseado de agregados proteicos desnaturalizados (de suero) no se consigue. Como resultado, el producto obtenido no tiene por lo tanto las propiedades deseadas y no puede usarse para el fin pretendido”.

La medición del grado de desnaturalización de acuerdo con la presente patente es laboriosa y consume tiempo y tendrá una duración de al menos 30 minutos hasta su compleción: En primer lugar la proteína desnaturalizada se precipita añadiendo ácido a pH 4, 6 seguido de filtración; la solución filtrada se analiza por cromatografía de HPLC de fase inversa y el grado de desnaturalización se calcula mediante la relación de áreas de pico de la muestra tratada con calor y la no calentada. Esto es claramente poco práctico en el contexto de cualquier procedimiento de producción comercial, dado que con frecuencia un cambio de solamente uno o dos ºC en la temperatura de procesamiento pueden suponer la diferencia entre tratamiento satisfactorio y gelificación catastrófica, y que pueden pasarse volúmenes relativamente grandes de fluido (típicamente decenas o cientos de litros) a través de la sección de calentamiento de la planta de producción durante cada minuto de operación.

También se conocen diversos otros procedimientos de medición del grado de desnaturalización, todos los cuales padecen desventajas significativas:

Calorimetría de exploración diferencial (DSC) :

Desventajas:

• Duración de las mediciones: al menos 30 minutos;

• No diferencia entre tamaños de partículas;

• No diferencia entre agregados solubles e insolubles.

Hidrofobicidad:

Desventajas:

• Sensibilidad limitada;

• No diferencia tamaño de partícula.

Dicroísmo circular (CD)

Desventajas:

• La muestra necesita lavarse abundantemente con nitrógeno durante el análisis;

• Duración: puesto que debe escanearse la solución proteica, la duración del análisis tarda de 30 5 minutos a 1 hora;

• Como DSC, la determinación de grupos SH, e hidrofobicidad solamente mide el grado de desnaturalización y no mide el tamaño de partículas o agregados.

Cromatografía de exclusión molecular

Desventajas:

• Duración del análisis: al menos 10 minutos;

• Requiere equipamiento complejo en planta de procesamiento. Espectroscopía: Absorbancia a 600 nm

Desventajas:

• No diferencia tamaño de partícula; 15 • Sensibilidad limitada.

Electroforesis en gel

Desventajas:

• Duración: 5-24 horas;

• Insensible.

Como se describe en el documento WO0249442, el presente inventor ha descubierto recientemente que, por medio de una desnaturalización inducida por calor cuidadosamente controlada de soluciones proteicas globulares, es posible obtener nuevos productos basados en proteínas con propiedades valiosas significativamente diferentes de los que pueden obtenerse por procedimientos de tratamiento térmico previamente conocidos. En más detalle, el inventor ha descubierto que, para proporcionar una limitación eficaz del procedimiento de tratamiento por calor, es

necesario supervisar la cantidad de grupos -SH reactivos. Sin embargo, para facilitar la utilización comercial más eficaz de un procedimiento tal, que en la práctica generalmente implicaría procesamiento de flujo continuo de volúmenes muy grandes (típicamente miles de litros) , existe la necesidad de proporcionar un medio rápido y sencillo de supervisar de forma eficaz la cantidad de grupos -SH reactivos formados en el procedimiento de tratamiento por calor, y la agregación de las moléculas proteicas desnaturalizadas resultantes de la reacción de estos grupos –SH

reactivos en el transcurso del procedimiento de tratamiento por calor, para permitir un control eficaz, más o menos en tiempo real, del procedimiento de tratamiento por calor. Los problemas prácticos principales que con frecuencia pueden encontrarse en el tratamiento por calor de soluciones proteicas, en ausencia de dicho control cuidadoso del procedimiento de tratamiento térmico, incluyen bloqueos de las líneas del procedimiento por gelificación (es decir “solidificación” sustancialmente completa de la solución proteica) o acumulaciones de agregados precipitados, y

quemado de tales agregados en superficies de intercambio de calor, que pueden dar como resultado pérdida sustancial o completa de material procesado, y tiempo de detención del aparato de producción sustancial para limpieza y reparación. También se apreciará que con cualquier procesamiento que implique productos naturales (tales como materiales de proteínas del suero) , pueden encontrarse variaciones muy considerables en las propiedades de la solución (tales como concentración... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para supervisar el grado de desnaturalización y agregación de proteínas durante el transcurso de un procedimiento de tratamiento por calor que comprende las etapas de:

calentar un fluido que contiene proteína acuosa a una temperatura correspondiente a una intensidad de

tratamiento por calor próxima a una intensidad de tratamiento por calor esperada previamente establecida; recoger una muestra de la solución proteica calentada; diluir dicha muestra o muestras en un tampón formulado de modo que:

el pH en dicha muestra esté sustancialmente sin cambios, las condiciones iónicas en dicha muestra estén sustancialmente sin cambios, y

la viscosidad de dicha muestra se mantenga al menos sustancialmente, todo en relación con la muestra no diluida, medir la turbidez de dicha muestra en relación con una muestra de control no tratada; comparar la medición de turbidez obtenida con los límites de medición de turbidez previamente establecidos correspondientes a un intervalo de tamaño de agregados proteicos medios deseado;

recoger una muestra de la solución proteica calentada; mezclar dicha muestra o muestras con un sistema de medición de reacción de grupo –SH químico; y comparar la medición del grupo SH obtenido con límites de medición de grupos SH previamente establecidos correspondientes a un grado deseado de desnaturalización.

20 2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la proteína es una globulina o proteína globular.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o reivindicación 2 en el que la proteína es una proteína del suero, yema de huevo o albúmina, huevo completo o proteína de soja.

4. El procedimiento de una reivindicación precedente cualquiera en la que el fluido que contiene proteína acuosa comprende una concentración de proteínas de 1 a 28% p/v.

25 5. El procedimiento de una reivindicación precedente cualquiera en la que el fluido que contiene proteína acuosa comprende una concentración proteica de más del 15% p/v.

6. Un procedimiento para controlar la intensidad del tratamiento por calor para fluidos que contienen proteína acuosa en los que la proteína está disuelta de forma sustancialmente completa de modo que se produzcan agregados proteicos desnaturalizados por calor de tamaño de partícula y funcionalidad deseados, que comprende las etapas

de:

supervisar el grado de desnaturalización y agregación de proteínas durante el transcurso de un procedimiento de tratamiento por calor como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y en el caso de cualquier desviación del tamaño de partícula o grado de desnaturalización deseado, ajustar la

intensidad del tratamiento por calor para conformarla al valor o los valores deseados.

7. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que la intensidad del tratamiento por calor es ajustado para conformar el tamaño de partícula y grado de desnaturalización al valor o valores deseados en caso de cualquier desviación del tamaño de partícula y grado de desnaturalización de los valores deseados.

8. El procedimiento de la reivindicación 6 o reivindicación 7 cuando se usa para controlar la intensidad del

tratamiento por calor en relación con establecimiento de una intensidad de tratamiento por calor para un nuevo producto; establecimiento de una intensidad de tratamiento por calor para un procedimiento para un producto existente cuando se usa un nuevo lote de material de partida; o para supervisar un procedimiento existente.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el fluido que contiene proteína acuosa

se calienta inicialmente a una temperatura por debajo de una intensidad de tratamiento por calor esperada 45 previamente establecida, y el procedimiento incluye las etapas de:

aumentar el ajuste a la intensidad de tratamiento por calor, y repetir las etapas precedentes para cada incremento de intensidad de tratamiento por calor; y discontinuar dicho aumento de intensidad del tratamiento por calor cuando dichas comparaciones indican que tanto el grado de desnaturalización como las mediciones de turbidez están dentro del intervalo

50 deseado.

10. El procedimiento de la reivindicación 9 en el que el fluido es calentado inicialmente a una temperatura menor que

o igual a 5 ºC por debajo de una intensidad de tratamiento por calor esperada previamente establecida.

11. El procedimiento de la reivindicación 9 o reivindicación 10 en el que dicho aumento de dicha intensidad de tratamiento por calor sirve para aumentar la temperatura de la solución proteica en incrementos de

aproximadamente 0, 5 a 1 ºC.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 en el que la intensidad del tratamiento por calor, si se ajusta, es cambiado por ajuste de la entrada de energía al calentador, modulación de cualquier sistema de transferencia de calor o intercambio de calor usado para transferir calor del calentador a la solución proteica, o

cambiando la duración del tratamiento por calor.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 cuando se usa para controlar un procedimiento de producción de flujo continuo o un procedimiento discontinuo.

14. Un procedimiento para preparar un producto de agregado proteico desnaturalizado por tratamiento por calor con un tamaño de partícula y funcionalidad deseados, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una solución proteica con un pH en el intervalo de 6 a 9 a una concentración proteica de hasta 30 de proteína p/p; y b) tratamiento por calor de dicha solución a una intensidad de tratamiento por calor correspondiente a un periodo de tiempo a una temperatura elevada, en el que dicha intensidad de tratamiento por calor se establece con la ayuda de un procedimiento de

control como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 13, en el que la intensidad de tratamiento por calor se aumenta progresivamente hasta que las mediciones de tanto el grado de desnaturalización como turbidez están dentro del intervalo deseado correspondiente a la funcionalidad y tamaño de partícula deseados.

15. El procedimiento de la reivindicación 14 en el que dicha concentración proteica es de hasta 20% p/p.