Compuestos novedosos.

Un kit de diagnóstico para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 2, o un fragmento de la misma;

(b) la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma;

(c) un polinucleótido que se puede obtener por tamizado de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación estrictas con una sonda etiquetada que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma, codificando dicho polinucleótido una proteína que tiene propiedades inmunogénicas similares a las de la proteína de SEC ID Nº: 2.

(d) un polipéptido de SEC ID Nº: 2, o un fragmento del mismo; o

(e) un anticuerpo del polipéptido de SEC ID Nº: 2.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06075141.

Solicitante: GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS SA.

Nacionalidad solicitante: Bélgica.

Dirección: RUE DE L''INSTITUT 89 1330 RIXENSART BELGICA.

Inventor/es: CASSART, JEAN-POL, COCHE, THIERRY, VINALS Y DE BASSOLS, CARLOTA, CABEZON SILVA,TERESA ELISA VIRGINIA, GAULIS,SWANN ROMAN JEAN-THOMAS.

Fecha de Publicación: 27 de Junio de 2012.

Clasificación Internacional de Patentes:

A61K31/711 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Acidos desoxirribonucleicos naturales, es decir conteniendo unicamente 2'-desoxirribosas unidas a la adenina, la guanina, la citosina o la timina y teniendo enlaces 3'-5' fosfodiester.
A61K38/17 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › que provienen de animales; que provienen de humanos.
C07K14/47 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.
C07K16/18 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales animales o humanos.
C12N1/21 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
C12N15/12 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas animales.
C12N15/62 C12N 15/00 […] › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
C12N15/70 C12N 15/00 […] › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a E. coli.
C12N15/85 C12N 15/00 […] › para células animales.
C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
G01N33/50 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).

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Fragmento de la descripción:

Compuestos novedosos

Se describen en esta invención composiciones farmacéuticas y procedimientos para inducir una respuesta inmunológica contra antígenos relacionados con tumores. Más específicamente, se describen polinucleótidos, en el presente documento referidos como polinucleótidos CASB7439, polipéptidos codificados por ellos (referidos en el presente documento como polipéptidos CASB7439) , materiales recombinantes y procedimientos para su producción. En otro aspecto, se describen procedimientos para usar tales polipéptidos y polinucleótidos, que incluyen el tratamiento del cáncer, más particularmente cáncer colorrectal, y enfermedades autoinmunológicas y otras afecciones relacionadas. En otro aspecto, se describen composiciones farmacéuticas que contienen polipéptidos y polinucleótidos CASB7439, a procedimientos de elaboración de tales composiciones y a su uso en medicina. En un aspecto adicional, se describen procedimientos para identificar agonistas y antagonistas/inhibidores que usan los materiales descritos en este documento, y que tratan afecciones asociadas con el desequilibrio de polipéptido CASB7439 con los compuestos identificados. La invención se refiere a pruebas de diagnóstico para detectar enfermedades asociadas con actividad o niveles inapropiados de polipéptido CASB7439.

Se cree que los polipéptidos y polinucleótidos descritos en este documento son inmunógenos importantes para la inmunización profiláctica o terapéutica específica contra tumores, porque se expresan específicamente o se sobreexpresan altamente en tumores en comparación con células normales y por consiguiente puede seleccionarse como objetivo por mecanismos inmunes específicos de antígeno que conducen a la destrucción de la célula tumoral. Pueden usarse también para diagnosticar la aparición de células tumorales. Además, su expresión inapropiada en algunas circunstancias puede ocasionar una inducción de respuestas inmunes inapropiadas, autoinmunes, las cuales podrían corregirse a través de vacunación apropiada usando los mismos polipéptidos o polinucleótidos. A este respecto, las actividades biológicas más importantes para nuestro propósito son las actividades antigénicas e inmunogénicas del polipéptido descritas en este documento. Un polipéptido descrito en este documento puede exhibir también al menos otra actividad biológica de un polipéptido CASB7439, que podría calificarlo como un objetivo para la intervención terapéutica o profiláctica diferente a la relacionada con la respuesta inmune.

Se describen en este documento polipéptidos CASB7439. Tales péptidos incluyen polipéptidos aislados, que comprenden una secuencia de aminoácidos la cual tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, a la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º:11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14 a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12,

o SEC ID N.º: 14 respectivamente, con la condición de que dicho polipéptido aislado no sea SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14. Tales polipéptidos incluyen aquellos que comprenden el aminoácido de la SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10 y SEC ID N.º:11.

Otros péptidos más incluyen polipéptidos aislados, en los cuales la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14, a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14 respectivamente, con la condición de que dicho polipéptido no sea SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14. Tales polipéptidos incluyen los polipéptidos de la SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10 y SEC ID N.º: 11.

Preferentemente los polipéptidos anteriormente mencionados se producen de manera recombinante. Lo más preferentemente, los polipéptidos de acuerdo con la invención se purifican, y están substancialmente libres de cualesquiera otras proteínas o material contaminante de origen de huésped.

Los péptidos adicionales descritos en este documento incluyen polipéptidos aislados codificados por un polinucleótido que comprende la secuencia contenida en SEC ID N.º: 1.

También se describe en este documento un fragmento inmunogénico de un polipéptido CASB7439, que es una porción contigua del polipéptido CASB7439 que tiene las mismas propiedades inmunogénicas o similares que el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14. Es decir, el fragmento (si es necesario cuando se acopla a un portador o como parte de una proteína de condensación más grande) es capaz de provocar una respuesta inmune que reconozca al polipéptido CASB7439. Un fragmento inmunogénico tal puede incluir, por ejemplo, el polipéptido CASB7439 que carece de una secuencia líder N-terminal, un dominio de transmembrana o un dominio de aseguramiento C-terminal. En un aspecto preferido del fragmento inmunogénico de CASB7439 de acuerdo con la invención comprende substancialmente todo el dominio extracelular de un polipéptido que tiene una identidad de al menos el 70 %, preferentemente una identidad de al menos el 80 %, más preferentemente una identidad de al menos el 90 %, aún más preferentemente una identidad de al menos el 95 %, lo máspreferentemente una identidad de al menos el 97-99 %, a aquella de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14, a lo largo de la longitud completa de la SEC ID N.º: 2, SEC ID N.º: 3, SEC ID N.º: 7, SEC ID N.º: 10, SEC ID N.º: 11, SEC ID N.º: 12, o SEC ID N.º: 14 respectivamente. Preferentemente, un fragmento inmunogénico de acuerdo con la invención comprende al menos un epitope.

Los fragmentos de péptido que incorporan un epitope de CASB7439 comprenderán normalmente al menos 7, preferentemente 9 ó 10 aminoácidos contiguos derivados de la SEC ID N.º: 2. Los epitopes preferidos se muestran en las SEC ID N.º: 16 a SEC ID N.º: 33.

Los péptidos que incorporan estos epitopes forman un aspecto preferido. Los mimotopes que tienen las mismas características que estos epitopes, y los inmunógenos que comprenden tales mimotopes que generan una respuesta inmune que reacciona de forma cruzada con un epitope en el contexto de la molécula CASB7439,

Se describen en este documento péptidos aislados que abarcan estos epítopes por si mismos, y cualquier mimotope de los mismos. El significado de mimotope se define como una entidad que es lo suficientemente similar al epitope CASB7439 nativo de modo que sea capaz de reconocerse por anticuerpos que reconocen la molécula nativa; (Gheysen, H.M., y col., 1986, Synthetic peptides as antigens. Wiley, Chichester, Ciba foundation symposium 119, p130-149; Gheysen, H.M.. 1986, Molecular Immunology, 23, 7, 709-715) ; o son capaces de producir anticuerpos, cuando se acoplan a un portador adecuado, cuyos anticuerpos reaccionan con la molécula nativa.

Los mimotopes de péptido de los epítopes anteriormente identificados pueden diseñarse para un propósito particular por adición, eliminación o substitución de los aminoácidos elegidos. Consecuentemente, los péptídos pueden modificarse para los propósitos de facilidad de conjugación a un portador de proteína. Por ejemplo, puede ser deseable para algunos procedimientos de conjugación química el incluir una cisteina terminal al epitope. Además puede ser deseable para los péptidos conjugados a un portador de proteína incluir un extremo hidrofóbo distal del extremo conjugado del péptido, de manera tal que el extremo no conjugado libre del péptido permanece asociado con la superficie de la proteína transportadora. Esto reduce los grados conformacionales de libertad del péptido, y aumenta así la probabilidad de que el péptido se presente en una... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Un kit de diagnóstico para llevar a cabo un ensayo de diagnóstico que comprende:

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 2,

o un fragmento de la misma;

(b) la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma;

(c) un polinucleótido que se puede obtener por tamizado de una biblioteca apropiada en condiciones de hibridación estrictas con una sonda etiquetada que tiene la secuencia de SEC ID Nº: 1 o un fragmento de la misma, codificando dicho polinucleótido una proteína que tiene propiedades inmunogénicas similares a las de la proteína de SEC ID Nº: 2.

(d) un polipéptido de SEC ID Nº: 2, o un fragmento del mismo; o

(e) un anticuerpo del polipéptido de SEC ID Nº: 2.

2. Un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad en un sujeto, o para diagnosticar la presencia de cáncer colorrectal o una susceptibilidad a cáncer colorrectal en un sujeto, relacionado con la expresión o la actividad de un polinucleótido en un sujeto, que comprende analizar la presencia o la cantidad del polinucleótido en una muestra derivada de dicho sujeto, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo constituido por:

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de SEC ID Nº: 2;

(b) el polinucleótido o la región de codificación del polinucleótido de SEC ID Nº: 1; y

3. Un procedimiento para diagnosticar una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad en un sujeto, o para diagnosticar la presencia de cáncer colorrectal o una susceptibilidad a cáncer colorrectal en un sujeto, relacionado con la expresión o la actividad de un polinucleótido en un sujeto, que comprende analizar la presencia o la cantidad del polinucleótido en una muestra derivada de dicho sujeto, en el que el polinucleótido se selecciona del grupo constituido por:

(a) un polinucleótido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 70 % de identidad con la SEC ID Nº: 2 en toda la longitud de la SEC ID Nº: 2;

(b) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2;

(c) un polipéptido que comprende un fragmento inmunogénico de un polipéptido de SEC ID Nº: 2 en el que la actividad inmunogénica del fragmento inmunogénico es sustancialmente la misma que el polipéptido de SEC ID Nº: 2;

(d) un fragmento de péptido de SEC ID Nº: 2 en el que el fragmento comprende una secuencia de una o más de SEC ID Nº: 16 a SEC ID Nº: 33.

Figura 1: datos de PCR en tiempo real usando la sonda de Taqman

Figura 3: SDS PAGE teñida con azul de Coomasie del extracto celular de la cepa que expresa CASB7439

Figura 4: prueba de bandas de Western cargada con extracto celular de la cepa que expresa CASB7439

Revelado con anti NS1 monoclonal

Figura 5: SDS PAGE teñida con azul de Coomasie de CASB7439 después de purificación Figura 6: prueba de bandas de Western CASB7439 después de purificación (anti-polihistidina monoclonal)

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