Ácido nucleico que comprende por lo menos una de las estructuras representadas por las siguientes fórmulas(16),

(16b), (17) o (17b); un tautómero o estereosiómero del ácido nucleico; o una sal del ácido nucleico, eltautómero o el estereoisómero: **Fórmula**

en el que en las fórmulas (16), (16b), (17) y (17b),

B es un grupo atómico que tiene un esqueleto de nucleobases naturales (adenina, guanina, citosina, timina ouracilo) o un esqueleto de nucleobases artificiales,

Z11 y Z12 son cada uno un átomo de hidrógeno, un grupo protector o un grupo atómico que muestra fluorescenciay muestra un efecto de excitón, y pueden ser idénticos o diferentes entre sí,

L1, L2, y L3 son cada uno un enlazador (un átomo o un grupo atómico de enlace), la longitud de la cadenaprincipal (el número de átomos de la cadena principal) es arbitraria, cada uno puede contener o no uno entre C,N, O, S, P, y Si en la cadena principal, cada uno puede contener o no uno entre un enlace simple, un dobleenlace, un triple enlace, un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un grupo imino, un enlace éter, unenlace tioéter, un enlace tioéster en la cadena principal, y L1, L2, y L3 pueden ser idénticos o diferentes entre sí,

D es CR, N, P, P≥O, B, o SiR, y R es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo o un sustituyente arbitrario,b es un enlace simple, un doble enlace o un triple enlace, o

en la fórmula (16) y (16b), L1 y L2 son cada uno un enlazador, L3, D, y b pueden no estar presentes, y L1 y L2pueden estar unidos directamente a B,

en el que en la fórmula (16) y (17),

E es un grupo atómico que tiene un esqueleto de desoxirribosa, un esqueleto de ribosas, o una estructuraderivada de cualquiera de ellos y por lo menos un átomo de O en un enlace de ácido fosfórico puede estarsustituido por un átomo de S,

en las fórmulas (16b) y (17b),

E es un grupo atómico que tiene una estructura peptídica o una estructura peptoide, y

en las fórmulas (17) y (17b),

las respectivas B pueden ser idénticas o diferentes entre sí, y los respectivos E pueden ser idénticos o diferentesentre sí.

Compuesto que tiene una estructura derivada de mononucleósido o mononucleótido, ácido nucleico, sustancia marcadora y método y kit para la detección de ácido nucleico

Campo técnico

La presente invención se refiere a un ácido nucleico, una sustancia marcadora y un método y un kit para detectar un ácido nucleico.

Antecedentes [0002] En, por ejemplo, los diagnósticos genéticos de enfermedades y el análisis de la expresión génica, es necesario detectar un ácido nucleico que tenga una secuencia específica. Para la detección, se utilizan ampliamente métodos que utilizan fluorescencia y, por ejemplo, se utiliza a menudo una sonda de fluorescencia obtenida mediante la unión covalente de un tipo de colorante fluorescente a ADN como sustancia marcadora.

Dicha sustancia marcadora (una sonda de fluorescencia) tiene el problema que, por ejemplo, emite fluorescencia incluso cuando no se ha formado una doble hélice con un ácido nucleico complementario. Para el objetivo de detener la fluorescencia de sólo la sonda, el método que utiliza transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) es efectivo (por ejemplo, documentos que no son patentes 1 a 4) . Sin embargo, presenta problemas en, por ejemplo, el coste debido a la introducción de dos tipos de colorantes fluorescentes.

El naranja de tiazol, que es un tipo de colorante de cianina, es conocido como un colorante fluorescente cuya intensidad de fluorescencia aumenta a través de la interacción con ADN o ARN. Existen ejemplos en los que se pretendió producir una sonda fluorescente con naranja de tiazol unido a ADN mediante un enlace covalente. Sin embargo, también se emite una fluorescencia intensa a través de la interacción con un ADN de cadena sencilla que contiene una base purina (documento no de patente 5) . Por consiguiente, el incremento en la intensidad de fluorescencia obtenido cuando se forma una doble hélice es pequeño y, por tanto, no se puede considerar como satisfactorio (documentos no de patente 6 y 7) .

Documento no de patente 1: Tyagi, S., Kramer, F. R. (1996) Nat. Biotechnol. 14, 303-308. Documento no de patente 2: Nazarenko, I. A., Bhatnagar, S. K., Hohman, R. J. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 2516-2521. Documento no de patente 3: Gelmini, S., Orlando, C., Sestini, R., Vona, G., Pinzani, P., Ruocco, L., Pazzagli, M. (1997) Clin. Chem. 43, 752-758. Documento no de patente 4: Whitcombe, D., Theaker, J., Guy, S. P., Brown, T., Little, S. (1999) Nat. Biotechnol. 17, 804-807. Documento no de patente 5: Biopolymers 1998, 46, 39-51. Documento no de patente 6: Analytica Chimica Acta 2002, 470, 57-70. Documento no de patente 7: Chemistr y - A European Journal 2006, 12, 2270-2281. WO 2006/097320 A2 describe nucleótidos modificados denominados macromoléculas Nuc. Las macromoléculas Nuc se caracterizan porque uno o más componentes nucleótidos están conectados con uno o más componentes (marcadores) macromoleculares que generan la señal o median en la seña a través de un enlazador. El componente de Nuk particular mantiene su función como sustrato para enzimas en una macromolécula Nuc. Un componente de señalización macromolecular puede albergar varias moléculas colorantes. También se describen métodos para marcar ácidos nucleicos con nucleótidos modificados.

Descripción detallada de la invención [0005] Por lo tanto, la presente invención pretende proporciona, por ejemplo, una sustancia marcadora que permite la doble estructura de hélice de un ácido nucleico a detectar de manera eficaz.

También se describe aquí un compuesto que tiene una estructura derivada de mononucleósido o mononucleótido, siendo la estructura representada por las siguientes fórmulas (1) , (1b) , o (1c) , un tautómero o estereoisómero de los mismos, o una sal de los mismos.

En las fórmulas (1) , (1b) , y (1c) , B es un grupo atómico que tiene un esqueleto de nucleobases naturales (adenina, guanina, citosina, timina o uracilo) o un esqueleto de nucleobases artificiales, E es:

(i) un grupo atómico que tiene un esqueleto de desoxirribosa, un esqueleto de ribosas, o una estructura derivada de cualquiera de ellos, o

(ii) un grupo atómico que tiene una estructura peptídica o una estructura peptoide,

Z11 y Z12 son cada uno un átomo de hidrógeno, un grupo protector o un grupo atómico que muestra fluorescencia y muestra un efecto de excitón, y pueden ser idénticos o diferentes entre sí, Q es: O, cuando E es un grupo atómico descrito en el punto (i) , o NH, cuando E es un grupo atómico descrito en el punto (ii) , X es: un átomo de hidrógeno, un grupo protector de un grupo hidroxilo que se puede desproteger con ácido, un grupo fosfato (un grupo monofosfato) , un grupo disfosfato o un grupo trifosfato, cuando E es un grupo atómico descrito en el punto (i) o un átomo de hidrógeno o un grupo protector de un grupo amino, cuando E es un grupo atómico descrito en el punto (ii) , Y es: un átomo de hidrógeno, un grupo protector de un grupo hidroxilo, o un grupo fosforamidita, cuando E es un grupo atómico descrito en el punto (i) , o un átomo de hidrógeno o un grupo protector, cuando E es un grupo atómico descrito en el punto (ii) , L1, L2, y L3 son cada uno un enlazador (un átomo o un grupo atómico de enlace) , la longitud de la cadena principal (el número de átomos de la cadena principal) es arbitraria. Cada uno puede contener o no uno de C, N, O, S, P, y Si en la cadena principal, cada uno puede contener o no uno de un enlace simple, un doble enlace, un triple enlace, un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un enlace imino, un enlace éter, un enlace tioéter, y un enlace tioéster en la cadena principal. L1, L2, y L3 pueden ser idénticos o diferentes entre sí, D es CR, N, P, P=O, B, o SiR, y R es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo o un sustituyente arbitrario, b es un enlace simple, un doble enlace o un triple enlace, o en la fórmula (1) , L1 y L2 son cada uno el enlazador mencionado anteriormente, L3, D, y b pueden no estar presentes, y L1 y L2 pueden estar unidos directamente a B, en la fórmula (1b) , T es: un enlace de ácido fosfórico (PO4-) en que por lo menos un átomo de oxígeno (O) puede estar sustituido con un átomo de azufre (S) , cuando E es un grupo atómico descrito en el punto (i) , o NH, cuando E es un grupo atómico descrito en el punto (ii) .

A efectos de resolver los problemas anteriores, la presente invención proporciona un ácido nucleico de la presente invención que es un ácido nucleico que incluye por lo menos una de las estructuras representadas por las siguientes fórmulas (16) , (16b) , (17) y (17b) , un tautómero o estereoisómero de los mismos, o una sal de los mismos. Cabe indicar, en la presente memoria, que en las fórmulas químicas (por ejemplo, las siguientes fórmulas químicas (16) , (16b) , (17) y (17b) , cuando un enlace se extiende desde el interior hacia el exterior de los paréntesis y el enlace está marcado con una estrella fuera de los paréntesis, la estrella significa que algún átomo o grupo atómico se une al enlace.

En la fórmulas (16) , (16b) , (17) y (17b) , B, E, Z11, Z12, L1, L2, L3, D, y b tienen cada uno la misma estructura que la de la fórmula (1) , (1b) , o (1c) , donde en las fórmulas (16) y (17) , E es un grupo atómico descrito en el punto (i) en la fórmula (1) , (1b) , o (1c) , y por lo menos un átomo de O en un enlace de ácido fosfórico puede estar sustituido con un átomo de S, en las fórmulas (16b) y (17b) , E es un grupo atómico descrito en el punto (ii) en la fórmula (1) , (1b) , o (1c) , y en las fórmulas (17) y (17b) , los respectivos B pueden ser idénticos o diferentes entre sí, y los respectivos E pueden ser idénticos o diferentes entre sí.

Además, una sustancia marcadora de la presente invención es:

(i) una sustancia marcadora que emite fluorescencia, con dos estructuras químicas planas contenidas en una molécula, que no existen en el mismo plano, sino con un cierto ángulo formado entre ellas, localizadas para disponerse en el mismo plano cuando la molécula experimenta una intercalación o unión en los surcos a un ácido nucleico

(ii) una sustancia marcadora formada de por lo menos dos grupos moleculares colorantes que no muestran emisión de fluorescencia debido al efecto de excitón obtenido cuando por lo menos dos moléculas colorantes se agregan en paralelo entre sí, pero muestran emisión de fluorescencia destruyéndose el estado de agregación cuando las moléculas experimentan una intercalación o unión en los surcos a un ácido nucleico, o

(iii) una... [Seguir leyendo]

1. Ácido nucleico que comprende por lo menos una de las estructuras representadas por las siguientes fórmulas (16) , (16b) , (17) o (17b) ; un tautómero o estereosiómero del ácido nucleico; o una sal del ácido nucleico, el tautómero o el estereoisómero:

en el que en las fórmulas (16) , (16b) , (17) y (17b) , B es un grupo atómico que tiene un esqueleto de nucleobases naturales (adenina, guanina, citosina, timina o uracilo) o un esqueleto de nucleobases artificiales, Z11 y Z12 son cada uno un átomo de hidrógeno, un grupo protector o un grupo atómico que muestra fluorescencia y muestra un efecto de excitón, y pueden ser idénticos o diferentes entre sí, L1, L2, y L3 son cada uno un enlazador (un átomo o un grupo atómico de enlace) , la longitud de la cadena principal (el número de átomos de la cadena principal) es arbitraria, cada uno puede contener o no uno entre C, N, O, S, P, y Si en la cadena principal, cada uno puede contener o no uno entre un enlace simple, un doble enlace, un triple enlace, un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un grupo imino, un enlace éter, un enlace tioéter, un enlace tioéster en la cadena principal, y L1, L2, y L3 pueden ser idénticos o diferentes entre sí, D es CR, N, P, P=O, B, o SiR, y R es un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo o un sustituyente arbitrario, b es un enlace simple, un doble enlace o un triple enlace, o en la fórmula (16) y (16b) , L1 y L2 son cada uno un enlazador, L3, D, y b pueden no estar presentes, y L1 y L2 pueden estar unidos directamente a B, en el que en la fórmula (16) y (17) , E es un grupo atómico que tiene un esqueleto de desoxirribosa, un esqueleto de ribosas, o una estructura derivada de cualquiera de ellos y por lo menos un átomo de O en un enlace de ácido fosfórico puede estar sustituido por un átomo de S, en las fórmulas (16b) y (17b) , E es un grupo atómico que tiene una estructura peptídica o una estructura peptoide, y en las fórmulas (17) y (17b) , las respectivas B pueden ser idénticas o diferentes entre sí, y los respectivos E pueden ser idénticos o diferentes entre sí.

2. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que en las fórmulas (16) y (17) , E es un grupo atómico que tiene una estructura de cadena principal de ADN, ADN modificado, ARN, ARN modificado o LNA; un tautómero o estereoisómero del compuesto; o una sal del compuesto, el tautómero o el estereoisómero, en el que en las fórmulas (16b) y (17b) , E es un grupo atómico que tiene una estructura de cadena principal de PNA (ácido nucleico de péptido) ; un tautómero o estereoisómero del compuesto; o una sal del compuesto, el tautómero o el estereoisómero.

3. Ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que en las fórmulas (16) , el grupo atómico representado por:

es un grupo atómico representado por las siguientes fórmulas (2-1) o (3-1) , en la fórmula (16b) , un grupo atómico representado por: es un grupo atómico representado por la siguiente fórmula (4-1) , en la fórmula (17) , un grupo atómico representado por: es un grupo atómico representado por las siguientes fórmulas (2b-1) o (3b-1) ,

en la fórmula (17b) , un grupo atómico representado por:

es un grupo atómico representado por la siguiente fórmula (4b-1) , en las fórmulas (2-1) , (3-1) , (4-1) , (2b-1) , (3b-1) , y (4b-1) , B son idénticas a las de, respectivamente, en la fórmula (16) , (16b) , (17) y (17b) , en las fórmulas (2-1) y (2b-1) , A es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alquilo, o un grupo atractor de electrones, en las fórmulas (3-1) y (3b-1) , M y J son cada uno CH2, NH, O, o S y pueden ser idénticos o diferentes entre sí, y en las fórmulas (2-1) , (3-1) , (2b-1) , y (3b-1) , por lo menos un átomo de O contenido en un enlace de ácido fosfórico puede estar sustituido por un átomo de S; un tautómero o estereoisómero del compuesto; o una sal del compuesto, el tautómero o el estereoisómero.

4. Ácido nucleico según la reivindicación 1 a 3, representado por las siguientes fórmulas (16-1) , (16-2) , (16b-1) , (16b-2) , (17-1) o (17b-1) ; un tautómero o estereoisómero del compuesto; o una sal del compuesto, el tautómero o el estereoisómero:

en el que en las fórmulas (16-1) , (16-2) , (16b-1) , (16b-2) , (17-1) , y (17b-1) , las longitudes de cadena l, m, y n son arbitrarias y pueden ser idénticas o diferentes entre sí, los enlazadores pueden contener o no uno de C, N, O, S, P, y Si en la cadena principal, los enlazadores pueden contener o no uno de un enlace simple, un doble enlace, un triple enlace, un enlace amida, un enlace éster, un enlace disulfuro, un grupo imino, un enlace éter, un enlace tioéter y un enlace tioéster en la cadena principal, y B, E, Z11 y Z12 son idénticos a los de las fórmulas (16) , (16b) , (17) o (17b) , respectivamente, en las fórmulas (16-1) y (16b-1) , b es idéntico al de la fórmula (16) o (16b) .

5. Ácido nucleico según la reivindicación 1 a 4, en el que Z11 y Z12 son cada uno independientemente un grupo derivado de naranja de tiazol, amarillo de oxazol, cianina, hemicianina, otro colorante de cianina, rojo de metilo, colorante azo, o un derivado de los mismos un tautómero o estereoisómero del compuesto; o una sal del compuesto, el tautómero o el estereoisómero.

6. Ácido nucleico según la reivindicación 1 a 4, en el que Z11 y Z12 son cada uno independientemente un grupo atómico representado por cualquiera de las siguientes fórmulas (7) a (9) : un tautómero o estereoisómero del compuestos o una sal del compuesto, el tautómero o el estereoisómero:

en el que en las fórmulas (7) a (9) , X1 y X2 son cada uno S u O y pueden ser idénticos o diferentes entre sí, n es 0 o un número entero positivo, R1 a R10 y R13 a R21 son cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, un grupo nitro, o un grupo amino, uno de R11 y R12 es un grupo de enlace que se une a L1 o L2 en las fórmulas (16) , (16b) , (17) o (17b) o NH en las fórmulas (16-1) , (16-2) , (16b-1) , (16b-2) , (17-1) o (17b-1) , y el otro es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior, cuando una pluralidad de R15 están presentes en la fórmula (7) , (8) , o (9) , pueden ser idénticos o diferentes entre sí, cuando una pluralidad de R16 están presentes en la fórmula (7) , (8) , o (9) , pueden ser idénticos o diferentes entre sí, y X1, X2 y R1 a R21 en Z11 y X1, X2 y R1 a R21 en Z12 pueden ser idénticos o diferentes entre sí, respectivamente, en el que opcionalmente en las fórmulas (7) a (9) , en R1 a R21, el grupo alquilo inferior es un grupo alquilo lineal o ramificado con un número de carbonos de 1 a 6, y el grupo alcoxi inferior es un grupo alcoxi lineal o ramificado con un número de carbonos de 1 a 6; y en el que opcionalmente en las fórmulas (7) a (9) , en R11 y R12, el grupo de enlace es un grupo de polimetilencarbonilo con un número de carbonos de por lo menos 2 y se unen a L1 o L2 en las fórmulas (16) , (16b) , (17) o (17b) o NH en las fórmulas (16-1) , (16-2) , (16b-1) , (16b-2) , (17-1) o (17b-1) , por un grupo carbonilo de los mismos.

7. Ácido nucleico según la reivindicación 1 a 6, que tiene una estructura representada por la siguiente fórmula (10-1) o (10-2) ; un tautómero o estereoisómero del compuesto; o una sal del compuesto, el tautómero o el estereoisómero:

en el que en la fórmula (10-1) , E, Z11 y Z12 son idénticos a los utilizados en la fórmula (16) , respectivamente; en la fórmula (10-2) , E, Z11 y Z12 son idénticos a los utilizados en la fórmula (16b) , respectivamente.

8. Ácido nucleico según la reivindicación 1 a 6, en el que en las fórmulas (16) , (16b) , (17) y (17b) , B es una estructura representada por Py, derivado de Pyr, Pu, o derivado de Pu; un tautómero o estereoisómero del compuesto; o una sal del compuesto, el tautómero, o el estereoisómero: en el que el Py es un grupo atómico que tiene un enlace covalente a E en una posición 1 y un enlace covalente a un grupo enlazador en una posición 5 en un anillo de seis miembros representado por la siguiente fórmula (11) , el derivado de Pyr es un grupo atómico en que por lo menos uno de todos los átomos del anillo de seis miembros de la Py ha sido sustituido por un átomo de N, C, S, u O, y el átomo de N, C, S, u O puede tener opcionalmente una carga eléctrica, un átomo de hidrógeno, o un sustituyente, la Pu es un grupo atómico que tiene un enlace covalente a E en una posición 9 y un enlace covalente a un grupo enlazador en una posición 8 en un anillo condensado representado por la siguiente fórmula (12) , y el derivado de Pu es un grupo atómico en que por lo menos uno de todos los átomos del anillo de cinco miembros de Pu ha sido sustituido por un átomo de N, C, S, u O, y el átomo de N, C, S, u O puede tener opcionalmente una carga eléctrica, un átomo de hidrógeno, o un sustituyente, estando el ácido nucleico representado por las siguientes fórmulas (13-1) , (13-2) , (14-1) o (14-2) :

en el que en las fórmulas (13-1) y (14-1) , E, Z11 y Z12 son idénticos a los de la fórmula (16) , respectivamente; en la fórmula (13-2) y (14-2) , E, Z11 y Z12 son idénticos a los de la fórmula (16b) , respectivamente.

9. Sustancia marcadora que emite fluorescencia con dos estructuras químicas planas contenidas en una molécula, que no existen en el mismo plano, sino con un cierto ángulo formado entre las mismas, localizadas de manera que están dispuestas en el mismo plano cuando la molécula experimenta una intercalación o unión en los surcos a un ácido nucleico, en la que la sustancia marcadora está formada preferiblemente de por lo menos dos grupos moleculares colorantes que no muestran emisión de fluorescencia debido al efecto de excitón obtenido cuando por lo menos dos moléculas colorantes se agregan en paralelo entre sí, pero muestran emisión de fluorescencia destruyéndose el estado de agregación cuando las moléculas experimentan una intercalación o unión en los surcos a un ácido nucleico, en el que la sustancia marcadora es: el ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que Z11 y Z12 son cada uno un grupo atómico que muestra fluorescencia y muestra un efecto de excitón; un tautómero o estereoisómero del ácido nucleico;

o una sal del ácido nucleico, el tautómero o el estereoisómero.

10. Sustancia marcadora compleja que tiene, como estructura química característica, una estructura química de por lo menos dos moléculas colorantes contenidas en una molécula, sin mostrar las por lo menos dos moléculas colorantes emisión de fluorescencia debido al efecto de excitón obtenido cuando se agregan en paralelo entre sí, pero mostrando emisión de fluorescencia destruyéndose el estado de agregación cuando las moléculas experimentan una intercalación o unión en los surcos a un ácido nucleico, teniendo opcionalmente la sustancia marcadora compleja una estructura en que por lo menos dos moléculas colorantes están unidas a una molécula enlazadora unida a un ácido nucleico a marcar, con una molécula enlazadora adicional interpuesta entre las mismas para tener una estructura ramificada, o unidas directamente a las mismas sin molécula de enlace adicional interpuesta entre las mismas, en la que las moléculas colorantes son cada una la sustancia marcadora descrita en la reivindicación 9.

11.Sustancia marcadora seleccionada entre mononucleótido marcado, oligonucleótido marcado, un ácido nucleico marcado y un análogo de ácido nucleico marcado, en la que la sustancia marcadora está marcada con: la sustancia marcadora según la reivindicación 9;

el ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que Z11 y Z12 son cada uno un grupo atómico que muestra fluorescencia y un efecto de excitón; un tautómero o estereoisómero del ácido nucleico; o una sal del ácido nucleico, el tautómero o el estereoisómero, opcionalmente con una molécula de enlace unida a un átomo de carbono en una posición 5 de un núcleo de pirimidina o un átomo de carbono en una posición 8 de un núcleo de purina de por lo menos una molécula base contenida en un mononucleótido, oligonucleótido, ácido nucleico o un análogo de ácido nucleico.

12. Método de detección de un ácido nucleico, que comprende las etapas de: llevar a cabo una síntesis de ácido nucleico utilizando, como sustrato, la sustancia marcadora según las reivindicaciones 9 u 11 que es un mononucleótido marcado u oligonucleótido marcado, sintetizando así un ácido nucleico de doble cadena al que está unido el grupo atómico que muestra fluorescencia o la estructura molecular colorante mediante intercalación o unión en los surcos; medir la intensidad de fluorescencia antes y después de la etapa de sintetizar el ácido nucleico de doble cadena; y detectar la síntesis de ácido nucleico mediante la comparación de las intensidades de fluorescencia entre sí que se obtienen antes y después de la etapa de síntesis del ácido nucleico de doble cadena.

13. Método de detección de un ácido nucleico, que comprende las etapas de: llevar a cabo la síntesis de ácido nucleico mediante la hibridación, como un primer ácido nucleico, de la sustancia marcadora según la reivindicación 11 que es un ácido nucleico de cadena sencilla, a un segundo ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria al primer ácido nucleico o una secuencia análoga a la secuencia complementaria, sintetizando así un ácido nucleico de doble cadena al que está unido el grupo atómico que muestra fluorescencia o la estructura molecular colorante mediante intercalación o unión en los surcos; medir la intensidad de fluorescencia antes y después de la etapa de sintetizar el ácido nucleico de doble cadena; y detectar la hibridación entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico mediante la comparación de las intensidades de fluorescencia entre sí que se obtienen antes y después de la etapa de síntesis del ácido nucleico de doble cadena.

14. Kit que comprende: una unidad de síntesis de ácido nucleico; una sustancia marcadora; y una unidad de medición de intensidad de fluorescencia, en el que la sustancia marcadora es la sustancia marcadora según las reivindicaciones 9 ó 11.