Composición de pigmento para el control de la transferencia de fluidos.

Kit para el control de las proporciones de composición, comprendiendo dicho kit:

a) un primer componente que comprende un primer pigmento que presenta un primer grupo de afinidad,siendo dicho primer pigmento excitable por una primera luz de excitación para emitir radiación o paratransferir energía a un segundo pigmento, y

b) un segundo componente que comprende un segundo pigmento que presenta un segundo grupo deafinidad, siendo excitable dicho segundo pigmento por una segunda luz de excitación o por latransferencia de energía a partir de dicho primer pigmento,

caracterizado porque dicho primer pigmento y dicho segundo pigmento se configuran de manera que:

- dicho primer grupo de afinidad es un primer oligonucleotido y dicho segundo grupo de afinidad esun segundo oligonucleótido que es complementario a dicho primer oligonucleótido, en el que dichosoligonucleótidos están compuestos de L-nucleótidos, y

- dichos primer y segundo grupos de afinidad presentan afinidad de unión entre sí, en los que latransferencia de energía entre dichos pigmentos se activa tras la unión de dicho primer grupo deafinidad a dicho segundo grupo de afinidad, y

- una mezcla de dichos primer y segundo pigmentos emite radiación al ser excitada con dichaprimera o dicha segunda luz de excitación, en la que dicha radiación es una medida de la proporción decomposición de dichos primer y segundo pigmentos.

Composición de pigmento para el control de la transferencia de fluidos

Antecedentes de la invención

Los pigmentos ya se utilizan en la actualidad como controles para configuraciones de ensayos que requieren el pipeteado de varios componentes.Los conceptos de control existentes se basan en pigmentos presentes únicamente dentro de un componente y en la detección del color secundario tras la mezcla con otros componentes.

Especialmente los sistemas de PCR en tiempo real requieren una mezcla exacta de todos los componentes de reacción para obtener una cuantificación fiable y comparable, ya que la cantidad de material de muestra, de cebadores/sondas, así como las mezclas maestras requeridas para la PCR en tiempo real, influyen particularmente sobre el resultado de la cuantificación.

La mezcla maestra de PCR con un pigmento inerte se utiliza para minimizar los errores de pipeteado y se encuentran disponibles productos comerciales, tales como RedTaq de Sigma Aldrich o AbsoluteBlue de ThermoScientific (Yanek M., BIOspektrum 13 (5) :519-520, 2007) . Alternativamente, los ingredientes (tales como, por ejemplo, la polimerasa) de los componentes pueden etiquetarse previamente a la mezcla, con el fin de obtener un control visual del procedimiento de pipeteado. Por ejemplo, RedTaq de Sigma Aldrich comprende una polimerasa etiquetada. La patente US nº 5.861.251 da a conocer reactivos de PCR liofilizados que comprenden un pigmento. Además, los materiales de sonda también pueden proporcionarse con un pigmento para la visualización (patente WO nº 2000/014505) . Se utilizan pigmentos fluorescentes tales como ROX y parejas de FRET ROX/FAM a modo de estándares de calibración (patente US nº 5.736.333) . Además, se han descritos composiciones y métodos para detectar ácidos nucleicos diana no marcados utilizando sondas polinucleótidas marcadas y antisondas parcialmente complementarias (patente WO nº 2008/021446) .Srisa-Art et al. han mostrado el control de la proporción de composición mediante la utilización de pigmentos marcados de afinidad (Analytical Chemistr y 79:6682-6689, 2007) .

En la actualidad no existen sistemas de control conocidos del estado de la técnica para sistemas de PCR en tiempo real en los que el pigmento de control debe optimizarse de manera que el pigmento de detección de la PCR en tiempo real no resulte afectado y, en consecuencia, la adsorción del pigmento de control no debe solaparse con las canales de detección utilizados para el seguimiento de la PCR y el pigmento de control debe detectarse en un canal separado. Lo anterior resulta más difícil en el caso de que resulte necesario utilizar dos o más pigmentos de control debido a que la ventana espectral del seguimiento de la PCR es reducida para evitar la contaminación cruzada con respecto a todos los pigmentos de control. La presente invención proporciona un sistema cerrado para la configuración de ensayo que comprende estrategias de control para identificar errores de volumen de por lo menos dos componentes que deben mezclarse para dichos ensayos.

Descripción resumida de la invención

Un aspecto de la presente invención es un kit para el control de la proporción de composición, comprendiendo dicho

kit:

a) un primer componente que comprende un primer pigmento que presenta un primer grupo de afinidad, siendo

dicho primer pigmento excitable por una primera luz de excitación para emitir radiación o para transferir energía a

un segundo pigmento, y

b) un segundo componente que comprende un segundo pigmento que presenta un segundo grupo de afinidad,

siendo dicho segundo pigmento excitable por una segunda luz de excitación o mediante transferencia de energía

a partir de dicho primer pigmento, caracterizado porque dicho primer pigmento y dicho segundo pigmento están

configurados de manera que:

- dicho primer grupo de afinidad es un primer oligonucleotido y dicho segundo grupo de afinidad es un

segundo oligonucleótido que es complementario a dicho primer oligonucleótido, en el que dichos

oligonucleótidos están compuestos de L-nucleótidos, y

- dichos primer y segundo grupos de afinidad presentan afinidad de unión entre sí, en los que la transferencia

de energía entre dichos pigmentos se activa tras la unión de dicho primer grupo de afinidad a dicho

segundo grupo de afinidad, y

- una mezcla de dichos primer y segundo pigmentos emite radiación al ser excitada con dicha primera o

dicha segunda luz de excitación, en la que dicha radiación es una medida de la proporción de composición

de dichos primer y segundo pigmentos.

La expresión "transferencia de energía" se utiliza en toda la presente invención para resumir todas las transferencias de energía no radiativa conocidas por el experto en la materia. Una realización bien conocida de dicha transferencia de energía es la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) . En la presente memoria, un cromóforo donante inicialmente en su estado excitado electrónico puede transferir energía a un cromóforo aceptor (en estrecha proximidad, típicamente <10 nm) mediante acoplamiento no radiativo dipolo-dipolo.

Otra posible transferencia de energía es la transferencia electrónica inducida por fotones (PET) . En este proceso, se aceptan electrones o se donan electrones al estado excitado de un pigmento fluorescente excitado, lo que resulta en la formación de una pareja de iones radicales que retorna al estado basal mediante recombinación no radiativa de cargas.

Dependiendo de los tipos de pigmento utilizados, la unión de dicho primer y dicho segundo grupos de afinidad puede ser reversible o irreversible.

En la totalidad de la descripción, la radiación emitida por la mezcla de pigmentos al excitarla con luz de excitación puede ser la radiación del pigmento excitado mismo o la radiación del otro pigmento no excitado por la luz de excitación, pero excitada indirectamente por la transferencia de energía desde el pigmento inicialmente excitado.

El término "pigmento" se utiliza para resumir todos los tipos de moléculas absorbentes de luz y, por lo tanto, comprende pigmentos fluorescentes, pigmentos no fluorescentes y moléculas inhibidoras.

Las moléculas inhibidoras son capaces de inhibir la fluorescencia de los pigmentos fluorescentes ya que son excitables por luz fluorescente y dispensan energía, por ejemplo calorífica. Los pigmentos no fluorescentes (también denominados moléculas donadoras oscuras) son pigmentos que no presentan sustancialmente emisión de fluorescencia, en contraste con los pigmentos fluorescentes convencionales.

Además, también pueden utilizarse estructuras aromáticas o heteroatomáticas que presentan propiedades de inhibición de la emisión de fluorescencia. Estas estructuras moléculas son capaces de absorber energía de los pigmentos fluorescentes mediante un proceso de transferencia electrónica fotoinducida (PET) . Son ejemplos de estructuras heteroaromáticas, por ejemplo, estructuras moleculares simples como la guanina, la deazaguanina (ver el Ejemplo 2) o la isoguanosina que también pueden añadirse a grupos de afinidad.

Asimismo, los derivados del indol tales como el triptófano en las proteínas o el nitroindol incorporado como derivado desoxirribósido son compuestos bien conocidos que presentan propiedades inhibidoras. Además, los nitroaromatos tales como los derivados 2, 4-dinitrofenilanilina, que se encuentran comercialmente disponibles como reactivos de marcaje para el marcaje de oligonucleótidos (en forma de fosforamidita) y de proteínas (en forma de ésteres de NHS) también son capaces de inhibir los fluoróforos.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es un kit para el control de la proporción de composición,

comprendiendo dicho kit: a) un primer componente que comprende un pigmento fluorescente que presenta un primer grupo de afinidad, siendo dicho primer pigmento excitable por una primera luz de excitación para transferir energía a una estructura aromática o heteroaromática, y b) un segundo componente que comprende una estructura aromática o heteroaromática que presenta un segundo grupo de afinidad, siendo... [Seguir leyendo]

1. Kit para el control de las proporciones de composición, comprendiendo dicho kit:

a) un primer componente que comprende un primer pigmento que presenta un primer grupo de afinidad, siendo dicho primer pigmento excitable por una primera luz de excitación para emitir radiación o para transferir energía a un segundo pigmento, y b) un segundo componente que comprende un segundo pigmento que presenta un segundo grupo de afinidad, siendo excitable dicho segundo pigmento por una segunda luz de excitación o por la transferencia de energía a partir de dicho primer pigmento,

caracterizado porque dicho primer pigmento y dicho segundo pigmento se configuran de manera que:

- dicho primer grupo de afinidad es un primer oligonucleotido y dicho segundo grupo de afinidad es un segundo oligonucleótido que es complementario a dicho primer oligonucleótido, en el que dichos oligonucleótidos están compuestos de L-nucleótidos, y -dichos primer y segundo grupos de afinidad presentan afinidad de unión entre sí, en los que la transferencia de energía entre dichos pigmentos se activa tras la unión de dicho primer grupo de afinidad a dicho segundo grupo de afinidad, y -una mezcla de dichos primer y segundo pigmentos emite radiación al ser excitada con dicha primera o dicha segunda luz de excitación, en la que dicha radiación es una medida de la proporción de composición de dichos primer y segundo pigmentos.

2. Kit según la reivindicación 1, en el que dicho primer pigmento es un pigmento fluorescente y dicho segundo pigmento es una molécula inhibidora, siendo dicha molécula inhibidora excitable mediante transferencia energética a partir de dicho pigmento fluorescente con la unión de los grupos de afinidad, de manera que dicha molécula inhibidora impide la emisión de fluorescencia de dicho pigmento fluorescente.

3. Kit según la reivindicación 2, en el que dicho pigmento fluorescente y dicha molécula de inhibidor son la misma molécula.

4. Kit según la reivindicación 1, en el que dicho primer pigmento es un primer pigmento fluorescente y dicho segundo pigmento es un segundo pigmento fluorescente, presentando dicho segundo pigmento fluorescente un máximo de excitación a una longitud de onda más larga que dicho primer pigmento fluorescente y en el que dicho segundo pigmento fluorescente es excitable por la transferencia de energía a partir de dicho primer pigmento fluorescente con la unión de los grupos de afinidad, de manera que dicho segundo pigmento fluorescente emite luz fluorescente que presenta una longitud de onda diferente de la longitud de onda de dicho primer pigmento fluorescente.

5. Kit según la reivindicación 1, en el que dicho primer pigmento es un pigmento no fluorescente y dicho segundo pigmento es un pigmento fluorescente, siendo dicho pigmento fluorescente excitable mediante transferencia energética a partir de dicho pigmento no fluorescente con la unión de los grupos de afinidad, de manera que dicho pigmento fluorescente emite luz fluorescente.

6. Kit para el control de las proporciones de composición, comprendiendo dicho kit:

a) un primer componente que comprende un pigmento fluorescente que presenta un primer grupo de afinidad, siendo dicho primer pigmento excitable por una primera luz de excitación para transferir energía a una estructura aromática o heteroaromática, y b) un segundo componente que comprende una estructura aromática o heteroaromática que presenta un segundo grupo de afinidad, siendo dicha estructura aromática o heteroaromática excitable mediante transferencia energética a partir de dicho primer pigmento, de manera que dicha estructura aromática o heteroaromática impide la emisión de fluorescencia de dicho pigmento fluorescente.

caracterizado porque dicho primer pigmento y dicha estructura aromática o heteroaromática están configurados de manera que:

- dichos primer y segundo grupos de afinidad presentan afinidad de unión entre sí, en los que la transferencia de energía entre dicho pigmento y dicha estructura aromática o heteroaromática se activa con la unión de dicho primer grupo de afinidad a dicho segundo grupo de afinidad, y -dicho primer grupo de afinidad es un primer oligonucleotido y dicho segundo grupo de afinidad es un segundo oligonucleótido que es complementario a dicho primer oligonucleótido, en el que dichos oligonucleótidos están compuestos de L-nucleótidos, y -una mezcla de dicho primer pigmento y dicha estructura aromática o heteroaromática emite radiación al ser excitada con dicha primera luz de excitación, en la que dicha radiación es una medida de la proporción de composición de dicho pigmento y dicha estrutura aromática o heteroaromática.

7. Método de verificación de las proporciones de composición de dos componentes utilizando el kit según las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) mezclar los dos componentes, en el que el primer componente comprende el primer pigmento que presenta dicho primer grupo de afinidad y el segundo componente comprende el segundo pigmento que presenta dicho segundo grupo de afinidad, b) llevar a cabo una primera medición de la radiación con la excitación con luz de excitación bajo condiciones en las que dicho primer pigmento y dicho segundo pigmento no se encuentran unidos entre sí mediante dichos grupos de afinidad, c) llevar a cabo una segunda medición de radiación tras la excitación por luz de excitación bajo condiciones en las que dicho primer pigmento y dicho segundo pigmento se encuentran unidos entre sí mediante dichos grupos de afinidad, y d) comparar las dos mediciones de radiación de las etapas b) y c) con el fin de verificar la proporción de composición de dichos dos componentes.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dichas primeras mediciones de la radiación de la etapa b) se llevan a cabo con dicho primer componente previamente a la mezcla de los dos componentes en la etapa a) .

9. Método según las reivindicaciones 7 y 8, en el que dichas primeras mediciones de radiación de la etapa b) se llevan a cabo mediante la aplicación de longitudes de onda de excitación específicas de dicho primer pigmento y midiendo la intensidad de la emisión de dicho primer pigmento.

10. Método según la reivindicación 7, en el que dichas primeras mediciones de radiación de la etapa b) se llevan a cabo mediante la aplicación de longitudes de onda de excitación específicas de dicho segundo pigmento y midiendo la intensidad de la emisión de dicho segundo pigmento.

11. Método según las reivindicaciones 7 a 10, en el que dichas segundas mediciones de radiación de la etapa c) se llevan a cabo mediante la aplicación de longitudes de onda de excitación específicas de dicho primer pigmento y midiendo la intensidad de la emisión de dicho segundo pigmento.

12. Método según las reivindicaciones 7 a 10, en el que dichas segundas mediciones de radiación de la etapa c) se llevan a cabo mediante la aplicación de longitudes de onda de excitación específicas de dicho primer pigmento y midiendo la intensidad de la emisión de dicho primer pigmento.

13. Método de verificación de las proporciones de composición de dos componentes según las reivindicaciones 4 y 5, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) mezcla de dos componentes, en la que el primer componente comprende el primer pigmento que presenta dicho primer grupo de afinidad y el segundo componente comprende el segundo pigmento que presenta dicho segundo grupo de afinidad, b) llevar a cabo una primera medición de la radiación tras la excitación por luz de excitación bajo condiciones en las que dichos primer y segundo pigmentos se encuentran unidos; dicha primera medición de la fluorescencia se lleva a cabo mediante aplicación de longitudes de onda de excitación específicas de dicho segundo pigmento y midiendo la intensidad de emisión de dicho segundo pigmento, y c) llevar a cabo una segunda medición de la radiación tras la excitación por luz de excitación bajo condiciones en las que dichos primer y segundo pigmentos se encuentran unidos; dicha segunda medición de la fluorescencia se lleva a cabo mediante aplicación de longitudes de onda de excitación específicas de dicho primer pigmento y midiendo la intensidad de emisión de dicho segundo pigmento, y d) comparar las dos mediciones de radiación de las etapas b) y c) con el fin de verificar la proporción de composición de dichos dos componentes.

14. Método de verificación de las proporciones de composición de dos componentes utilizando el kit según la reivindicación 6, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) mezcla de dos componentes, en la que el primer componente comprende el pigmento fluorescente que presenta dicho primer grupo de afinidad y el segundo componente comprende la estructura aromática o heteroaromática que presenta dicho segundo grupo de afinidad, b) llevar a cabo una primera medición de la radiación tras la excitación por luz de excitación bajo condiciones en las que dicho pigmento fluorescente y dicha estructura aromática o heteroaromática no se encuentran unidos entre sí mediante grupos de afinidad; dicha primera medición de la radiación se lleva a cabo mediante aplicación de longitudes de onda de excitación específicas de dicho pigmento fluorescente y midiendo la intensidad de emisión de dicho pigmento fluorescente, c) llevar a cabo una segunda medición de la radiación tras la excitación por luz de excitación bajo condiciones en las que dicho pigmento fluorescente y dicha estructura aromática o heteroaromática no