COMPLEJOS COVALENTES DE LIPASAS CON PROTEINAS, SONDAS DE ADN, COFACTORES U OTRAS BIOMOLECULAS.
Complejos covalentes de lipasas con proteínas, sondas de ADN, cofactores u otras biomoléculas.
Complejos que comprenden lipasas unidas covalentemente, a través de regiones no involucradas en su centro activo, a biomoléculas de interés (proteínas, como enzimas, anticuerpos o proteínas A o G, cofactores o sondas de ADN). Los complejos se pueden inmovilizar a través del centro activo intacto de las lipasas sobre todo tipo de soportes hidrofóbicos sin necesidad de realizar modificaciones o activaciones en los mismos. La unión de la lipasa a los soportes hidrofóbicos es reversible, lo que permite la inmovilización reversible de los complejos. La invención proporciona dos métodos, químico y biológico, de preparación de estos complejos y un método de inmovilización de los mismos. Estos complejos inmovilizados pueden tener aplicaciones en la industria, en el laboratorio o en diagnóstico, debido a su uso potencial como biocatalizadores o como biosensores. El método químico comprende la adsorción de la lipasa a un soporte hidrofóbico poroso, la conjugación de la lipasa así adsorbida con la biomolécula y desorber este complejo del soporte mediante el uso de detergentes. El método biológico comprende la inserción del gen de la biomolécula en un plásmido conteniendo el gen de la lipasa, en un microorganismo, para que éste exprese la lipasa fusionada a la biomolécula.
La inmovilización reversible de los complejos creados a partir de cualquiera de los dos métodos se puede realizar en soportes hidrofóbicos no porosos.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200930242.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: MADRID.
Inventor/es: GUISAN SEIJAS,JOSE MANUEL, MATEO GONZALEZ,CESAR, FERNANDEZ LORENTE,GLORIA, PALOMO CARMONA,JOSE MIGUEL, LOPEZ GALLEGO,FERNANDO, BATALLA BOSQUET,PILAR, BILIBAR BOLIVAR,JUAN MANUEL, MACIELLO,MARZIA.
Fecha de Solicitud: 1 de Junio de 2009.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 16 de Enero de 2012.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N11/06 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 11/00 Enzimas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Células microbianas fijadas sobre un soporte o inmovilizadas; Su preparación. › unidas al soporte por medio de un agente de puenteo.
- C12N15/62 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
- C12N9/20 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Escisión de triglicéridos, p. ej. por medio de lipasa.
Clasificación PCT:
PDF original: ES-2352779_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Complejos covalentes de lipasas con proteínas, sondas de ADN, cofactores u otras biomoléculas.
La presente invención se encuadra en el campo de la bioquímica y la biología molecular y se refiere a unos complejos que comprenden lipasas unidas covalentemente, a través de regiones no involucradas en su centro activo, a biomoléculas de interés (proteínas u otras biomoléculas). Los complejos se pueden inmovilizar posteriormente a través del centro activo intacto de las lipasas sobre todo tipo de soportes hidrofóbicos. También se refiere a dos métodos, químico y biológico, de preparación de estos complejos y a un método de inmovilización de los mismos. Estos complejos inmovilizados pueden tener aplicaciones en la industria, en el laboratorio o en diagnóstico, debido a su uso potencial como biocatalizadores o como biosensores.
Estado de la técnica anterior
La inmovilización de biomoléculas de interés industrial o biomédico es, en muchos casos, una etapa necesaria en el desarrollo de biocatalizadores y de biosensores. La mayoría de los soportes disponibles para tal fin son de naturaleza hidrofóbica, como por ejemplo, la mayoría de las partículas magnéticas comerciales (como los núcleos de ferrita recubiertos de poliestireno), los nanotubos de carbono, las placas multipocillo, algunas placas para preparar arrays, etc. Sin embargo, la inmovilización de proteínas y otras biomoléculas sobre estas superficies hidrofóbicas genera una serie de problemas, como la inactivación de la biomacromolécula (Mateo, C., et al., 2002, Biotechnology Progress, 18:3, 629-634). Además, este tipo de soportes podrían adsorber de forma inespecífica analitos, lo que dificulta su empleo como biosensores. Algunas de estas nanoestructuras se derivatizan con dificultad, incluso una vez derivatizadas no se pueden manipular fácilmente. Es el caso de las nanopartículas magnéticas, que pueden agregar en presencia de codisolventes, alta fuerza iónica, reactivos polifuncionales, etc. Solucionar estos inconvenientes supondría la posibilidad de aplicar, en la industria o en diagnóstico, estas biomacromoléculas inmovilizadas.
Por otro lado, el desarrollo de técnicas de inmovilización reversibles aportaría una serie de ventajas en la inmovilización de biomoléculas. Por ejemplo, cuando el soporte es muy caro o el reactor muy complejo, la posibilidad de reutilización sería interesante (You, C., et al., 2009, Talanta, 78:3, 705-710).
Se han desarrollado métodos de inmovilización covalente de biomoléculas sobre carriers y membranas en presencia de His-Tag, cuyos residuos de aminoácidos están directamente implicados en la unión covalente. Para aumentar la probabilidad de inmovilización se puede incrementar la hidrofobicidad de la membrana (EP0991944 A1).
Por otro lado, la unión no específica de las biomoléculas a los nanotubos de carbono se puede superar mediante la unión de las proteínas diana a cadenas de óxido de polietileno presentes en los nanotubos (Robert J. Chen, 2003, PNAS, 100:9, 4984-4989).
Otra aproximación es el recubrimiento de las nanopartículas con sílice para la unión de biomoléculas activas, como anticuerpos, enzimas o nucleótidos, para marcar células, detectar y/o aislar moléculas de ácidos nucleicos que tienen secuencias nucleotídicas específicas, etc. (WO03089906 A2).
La regeneración de cofactores como NAD, NADP, NADPH, ATP, UDP, etc., es un problema en el diseño de multitud de biotransformaciones. Una solución pasa por la inmovilización del cofactor en nanopartículas no porosas, usando las enzimas implicadas en el proceso también en este tipo de soporte (Liu, W., et al., 2009, Journal of Biotechnology, 139:1, 102-107). No obstante, sería necesario disponer de cofactores inmovilizados en partículas de forma reversible, de manera que se simplifiquen los sistemas de reciclado de estas moléculas.
En el caso de las enzimas, en aquellas que deben actuar sobre sustratos insolubles (como celulasas o proteasas), sería interesante el uso de nanopartículas no porosas para inmovilizar grandes cantidades de estas enzimas en la superficie del soporte y poder realizar este tipo de reacciones. Sin embargo, su pequeño tamaño hace que su manejo sea complicado. El uso de partículas magnéticas sería una simplificación, pero dado su elevado precio es un sistema de difícil uso a corto plazo. Además, la mayoría de las nanopartículas que son estables son hidrofóbicas, lo que provoca su agregación y la posible inactivación de las biomacromoléculas inmovilizadas sobre ellas.
Las lipasas presentan una gran afinidad por las superficies hidrofóbicas (Bastida, A., et al., 1998, Biotechnology and Bioengineering, 58:5, 486-493) y existen en la naturaleza en dos conformaciones. Tienen su centro activo en un bolsillo extremadamente hidrofóbico y realizan sus funciones en la interfase de las gotas de sus sustratos (gotas de aceite). En medios acuosos homogéneos, la forma mayoritaria de las lipasas es aquella en la que el centro activo se encuentra aislado del medio por una cadena polipeptídica llamada "lid", siendo considerada inactiva. En presencia de superficies hidrofóbicas, las lipasas sufren un cambio conformacional, adsorbiéndose a ellas a través de la cara interna del lid (que es hidrofóbica) y de las zonas hidrofóbicas que rodean al centro activo, lo que conduce a una fuerte adsorción. Un ejemplo de ello es que las lipasas pueden exponerse a concentraciones del 30-40% de codisolventes orgánicos sin que sean liberadas al medio. Sin embargo, a pesar de esta gran afinidad por los soportes hidrofóbicos, éstos pueden ser fácilmente recuperados sin necesidad de inducir en ellos modificaciones, sino simplemente lavándolos con altas concentraciones de detergentes, que son capaces de liberar las lipasas (Bastida, A., et al., 1998, Biotechnology and Bioengineering, 58:5, 486-493).
El desarrollo de métodos sencillos de inmovilización de biomoléculas sobre nanoestructuras y otros soportes hidrofóbicos es fundamental para poder llevar a cabo las aplicaciones de las mismas. Estos métodos deben permitir la unión selectiva de la biomolécula de interés, es decir, sin que existan interacciones inespecíficas con otras moléculas, ya que de otra manera sus aplicaciones como biocatalizadores o como biosensores se encontrarían muy limitadas. Además, en algunos casos sería interesante que estos métodos permitieran la reutilización del soporte una vez que ha sido utilizado.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona unos complejos que comprenden lipasas unidas covalentemente, a través de regiones no involucradas en su centro activo, a biomoléculas de interés (proteínas u otras biomoléculas). Los complejos se pueden inmovilizar posteriormente a través del centro activo intacto de las lipasas sobre todo tipo de soportes hidrofóbicos. También se refiere a dos métodos, químico y biológico, de preparación de estos complejos y a un método de inmovilización de los mismos. Estos complejos inmovilizados pueden tener aplicaciones en la industria, en el laboratorio o en diagnóstico, debido a su uso potencial como biocatalizadores o como biosensores.
La lipasa actúa como proteína transportadora y se inmoviliza por activación interfacial sobre partículas magnéticas hidrofóbicas u otros soportes hidrofóbicos sin necesidad de realizar ningún tipo de modificación o activación previa de los soportes. De manera que, una vez unida la biomolécula a la lipasa, se puede llevar a cabo la inmovilización de este complejo sobre un soporte hidrofóbico evitando la inactivación de la biomolécula, al ser la lipasa la que se adsorbe por interacción interfacial sobre la nanopartícula hidrofóbica. La inmovilización de la lipasa es rápida, intensa, reversible y se puede realizar en condiciones experimentales suaves. Una vez utilizadas las nanoestructuras o soportes hidrofóbicos, se pueden recuperar desorbiendo los complejos con altas concentraciones de detergente, permitiendo así la reutilización de los soportes para la adsorción de nuevos complejos.
Los complejos son sencillos de preparar, tanto por métodos químicos como biológicos. Además, esta inmovilización de las biomoléculas sobre las superficies, incluso cuando éstas son pequeñas, se puede cuantificar siguiendo la actividad catalítica de la lipasa transportadora. El hecho de que la proteína transportadora, es decir, la lipasa, posea una alta actividad catalítica hacia substratos sintéticos facilita la cuantificación... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Complejo que comprende una lipasa unida covalentemente a una biomolécula.
2. Complejo según la reivindicación 1 donde la lipasa procede de un microorganismo termófilo.
3. Complejo según la reivindicación 2 donde el microorganismo termófilo es: Bacillus thermocatenulatus o Thermus thermophillus.
4. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la biomolécula es una proteína.
5. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la proteína es un anticuerpo.
6. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la proteína es: proteína A o proteína G.
7. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la proteína es una enzima.
8. Complejo según la cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la biomolécula es un cofactor.
9. Complejo según la reivindicación 8 donde el cofactor se selecciona de la lista que comprende: NAD(P)+, NAD(P)H, ATP, ADP o FAD.
10. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la biomolécula es una sonda de ADN.
11. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 que, además, comprende un polímero activable entre la lipasa y la biomolécula.
12. Complejo según la reivindicación 11 donde el polímero activable es dextrano.
13. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que, además, se encuentra inmovilizado en un soporte hidrofóbico no poroso.
14. Complejo según la reivindicación 13 donde el soporte hidrofóbico se selecciona de la lista que comprende: nanotubo de carbono, array hidrofóbico, array hidrofobizado, placa multipocillo, nanopartícula magnética hidrofóbica o nanopartícula no magnética hidrofóbica.
15. Complejo según la reivindicación 14 donde la nanopartícula magnética hidrofóbica es un núcleo de ferrita recubierto de poliestireno.
16. Método de preparación química del complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que comprende:
17. Método de preparación química del complejo según la reivindicación 16, donde el soporte sólido hidrofóbico del paso (a) es: octil-agarosa o vidrio recubierto de grupos alquilo de entre C4-C18.
18. Método de preparación química del complejo según la reivindicación 16, donde el soporte sólido hidrofóbico del paso (a) tiene una superficie hidrofílica recubierta de nanoestructuras hidrofóbicas.
19. Método de preparación química del complejo según la reivindicación 18, donde las nanoestructuras hidrofóbicas se seleccionan de la lista que comprende: proteínas hidrofóbicas, moléculas de proteínas hidrofóbicas, proteínas hidrofílicas modificadas con reactivos hidrofóbicos, polímeros hidrofóbicos o polímeros hidrofílicos modificados con reactivos hidrofóbicos.
20. Método de preparación química del complejo según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 donde la lipasa del paso (a) se modifica con dienofilos, con grupos amino ionizados recubiertos de grupos epóxidos o de grupos glutaraldehído o con polímeros activados para conjugarse químicamente con biomoléculas.
21. Método de preparación química del complejo según la reivindicación 20, donde los polímeros activados contienen grupos carboxilo, grupos epóxido o grupos amino.
22. Método de preparación biológica del complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende insertar el gen de la biomolécula en un plásmido conteniendo el gen de la lipasa.
23. Uso del complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la inmovilización de biomoléculas en soportes hidrofóbicos.
24. Método de obtención del complejo según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, que comprende los pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 o del método según la reivindicación 22, y además:
25. Método de obtención del complejo según la reivindicación 24 que, además, comprende:
26. Uso del complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, 7 a 9 u 11 a 15 como biocatalizador.
27. Uso del complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 como biosensor.
28. Uso del complejo según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 u 11 a 15 para la regeneración de cofactores inmovilizados.
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