Cepas probióticas, un procedimiento para la selección de ellas, composiciones de las mismas y su uso.

Método para la selección de cepas microbianas probióticas, que comprende las siguientes etapas:

a. seleccionar cepas no patógenas que pueden sobrevivir en la leche materna y/o el líquido amniótico, y

b. seleccionar cepas no patógenas que pueden transferirse a la leche materna y/o el líquido amniótico tras la ingesta oral en individuos sanos sin colonizar otros órganos internos excepto mucosas.

Cepas probióticas, un procedimiento para la selección de ellas, composiciones de las mismas y su uso

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento novedoso para la selección de nuevas cepas probióticas, a nuevos microorganismos probióticos del género Lactobacillus seleccionados según este método y a composiciones que comprenden estos microorganismos; a su uso para la profilaxis o el tratamiento frente a enfermedades digestivas, infecciosas, neurodegenerativas y relacionadas con el sistema inmunitario tales como alergias o enfermedades inflamatorias, y a una fuente novedosa para obtener dichos microorganismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Durante muchos años, se han utilizado las bacterias del ácido láctico como agentes de fermentación para la conservación de alimentos beneficiándose de un pH bajo y de la acción de productos de fermentación generados durante la actividad fermentativa de las mismas para inhibir el crecimiento de bacterias degradantes. Con este objetivo, se han usado bacterias del ácido láctico mal caracterizadas o “fermento” para preparar una variedad de diferentes productos alimenticios tales como productos cárnicos fermentados secos, queso y otros productos lácteos fermentados a partir de leche.

Recientemente, las bacterias del ácido láctico han atraído una gran atención debido a que se ha encontrado que algunas cepas muestran propiedades valiosas para el hombre y los animales tras su ingestión. En particular, se ha encontrado que cepas específicas del género Lactobacillus o Bifidobacterium pueden colonizar la mucosa intestinal y ayudar en el mantenimiento del bienestar del hombre y el animal, y se han denominado como probióticas.

Las cepas probióticas se considera que son preparaciones microbianas viables que estimulan la salud del individuo conservando una microflora más sana en el intestino. Una preparación microbiana puede aceptarse comúnmente como probiótica en el caso de que se conozca el efecto de la misma y su modo de acción. Se considera que las cepas probióticas se unen a la mucosa del intestino, colonizan el tracto intestinal y asimismo impiden la unión de microorganismos nocivos sobre el mismo. Un requisito previo crucial para su acción reside en que deben alcanzar la mucosa del intestino en una forma apropiada y viable y no destruirse en la parte superior del tracto gastrointestinal, especialmente por la influencia del pH bajo que prevalece en el estómago.

Durante los estudios extensos que conducen a nuevas cepas probióticas, solicitudes de patente previas han descrito el aislamiento de una variedad de diferentes cepas bacterianas a partir de heces de bebé (documentos JP04320642, JP05227946) . Además, las cepas probióticas obtenidas hasta la fecha se seleccionaron principalmente por su capacidad de adherirse a la mucosa intestinal, habitualmente mediante experimentos in vitro. No siempre se ha realizado selección posterior, y si se ha hecho, solía basarse principalmente en propiedades individuales de la cepa. Finalmente, y algunas veces tras la comercialización de la cepa, se han comprobado in vivo los efectos beneficiosos de la cepa seleccionada.

En este aspecto, varias solicitudes de patente tales como, por ejemplo, EP0768375, WO97/00078, EP0577903 y WO00/53200 dan a conocer cepas específicas de Bifidobacterium y Lactobacillus y sus efectos beneficiosos sobre la diarrea, inmunomodulación, reacciones de hipersensibilidad o infección por microorganismos patógenos.

Además, también se han notificado de manera extensa los efectos beneficiosos de la leche materna humana sobre el bienestar de los lactantes en comparación con los alimentados con preparado a base de leche. En este aspecto, se ha descrito una reducción en el riesgo de infección, alergia, asma y

afecciones relacionadas, y una mejora de la maduración

intestinal y las funciones del intestino. Además, se ha

notificado que la composición de la flora intestinal es

diferente en lactantes alimentados con leche humana respecto a

los alimentados con preparado a base de leche. Los efectos beneficiosos y la modulación de la flora intestinal de la leche materna humana se han atribuido a su composición característica en comparación con preparados para lactantes. Por tanto, se han notificado los beneficios de proteínas de la leche materna tales como lactoferrina o inmunoglobulinas maternas y la rica composición en oligosacáridos que pueden actuar como compuestos prebióticos, en la regulación de la flora y las funciones del intestino.

Sin embargo, a nuestro entender, no hay ninguna publicación o trabajo que describa la presencia de cepas microbianas en leche materna humana normal. Tampoco se ha notificado que tales cepas microbianas pudiesen ser beneficiosas para el bebé amamantado, y por tanto actuar como cepas probióticas que modulan la flora intestinal del lactante amamantado. Este trabajo sugiere que los efectos de bienestar de los seres humanos amamantados también podrían mediarse mediante cepas microbianas presentes en la misma.

Se ha sugerido en varios trabajos que la colonización inicial del recién nacido se debe a la contaminación cruzada con microflora de la vagina durante el parto. Sin embargo, hay varios estudios que muestran una colonización microbiana inicial similar del recién nacido independientemente de la vía de alumbramiento del recién nacido (cesárea frente a parto natural) . Además, el hecho de que no sea posible obtener animales libres de gérmenes a partir de ratones preñados convencionales a pesar de que se hayan obtenido por cesárea, y que estos animales también podrían obtenerse tras el alumbramiento del embrión en ratones receptores estériles (Okamoto, M. y Matsumoto, T. 1999. Exp. Anim. 48: 59-62) , sugiere que debe haber otros mecanismos diferentes de la contaminación vaginal que también influyen en la colonización inicial del recién nacido y que este mecanismo debe comenzar antes del parto.

En este aspecto, a nuestro entender, no hay ninguna publicación o trabajo que describa la presencia de cepas bacterianas del ácido láctico en el líquido amniótico humano normal. Tampoco se ha notificado que tales cepas microbianas no patógenas pudiesen ser beneficiosas para el bebé en gestación, y por tanto condicionar, justo durante la gestación, las poblaciones microbianas iniciales que pueden colonizar el

intestino fetal.

Al entender las propiedades valiosas que pueden proporcionar cepas particulares de bacterias del ácido láctico, hay un deseo en la técnica de obtener cepas bacterianas del ácido láctico adicionales que sean beneficiosas para el

bienestar del hombre y/o los animales. En consecuencia, un problema de la técnica anterior era proporcionar métodos racionales para la selección de nuevas cepas bacterianas adicionales y fuentes novedosas para la selección de las mismas, que permitan la obtención de cepas bacterianas que muestren individualmente un alto número de propiedades beneficiosas para el hombre y/o los animales. El problema anterior se ha solucionado proporcionando microorganismos novedosos, concretamente bacterias del ácido láctico, que pertenecen al género Lactobacillus. Estas nuevas cepas se han obtenido a partir de diferentes fuentes aparte de heces, tales como queso de cabra y a partir de leche materna humana y líquido amniótico, y se han elegido mediante un método que consiste en la capacidad de estas cepas de sobrevivir el líquido amniótico, y por su capacidad para transferirse al líquido amniótico tras la ingesta oral. Este método de selección garantiza que las cepas bacterianas obtenidas tienen implícitamente la mayoría de las características atribuidas a una posible cepa probiótica, concretamente buena resistencia al proceso de digestión y la capacidad de colonización del intestino, pero también un origen humano más natural, aspectos de seguridad y la capacidad de colonizar y regular algunos nichos humanos diferentes del intestino. Finalmente, las cepas seleccionadas también se han sometido a prueba no sólo para determinar sus capacidades de adhesión sino para determinar si tienen un alto grado de características beneficiosas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Método de selección: supervivencia de bacterias en la leche materna y el líquido amniótico.

Esta figura ilustra la tasa de supervivencia de las cepas probióticas seleccionadas de esta invención en la leche materna y el líquido amniótico. Según el método de selección, se midió la supervivencia de las posibles cepas probióticas usando leche materna humana (barras grises) y líquido amniótico (barras negras) . Se resuspendieron 10ufc de cualquier cepa bacteriana... [Seguir leyendo]

1. Método para la selección de cepas microbianas probióticas, que comprende las siguientes etapas:

a. seleccionar cepas no patógenas que pueden sobrevivir en el líquido amniótico, y

b. seleccionar cepas no patógenas que pueden transferirse al líquido amniótico tras la ingesta oral en individuos sanos sin colonizar otros órganos internos excepto mucosas.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el líquido amniótico es de fuentes humanas.

3. Método según la reivindicación 2, en el que las cepas probióticas sometidas a prueba son cualquier bacteria del ácido láctico seleccionada de los géneros: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Streptococcus y Bifidobacterium.

4. Método según la reivindicación 3, en el que las cepas probióticas sometidas a prueba se habían obtenido previamente de: leche materna, heces de bebés amamantados o líquido amniótico.

5. Método según la reivindicación 4, en el que las cepas sometidas a prueba se habían obtenido de muestras humanas.

6. Cepa de bacteria depositada en la CECT con el nº de registro 5711 (Lactobacillus cor y niformis) .

7. Cepa de bacteria depositada en la CECT con el nº de registro 5713 (Lactobacillus salivarius subsp. salivarius) .

8. Cepa de bacteria depositada en la CECT con el nº de registro 5714 (Lactobacillus gasseri, anteriormente L. acidophilus) .

9. Cepa de bacteria depositada en la CECT con el nº de registro 5715 (Lactobacillus gasseri) .

10. Cepa de bacteria depositada en la CECT con el nº de registro 5716 (Lactobacillus fermentum) .

11. Cultivo biológicamente puro de una cepa según cualquiera de las reivindicaciones 6-10.

12. Composición que comprende al menos una de las cepas bacterianas definidas en las reivindicaciones 6 a 10, en la que la composición comprende preferiblemente desde 2 hasta 6 cepas, más preferiblemente desde 2 hasta 4 cepas, lo más preferiblemente desde 2 hasta 3 cepas, y en la que cada una de las cepas está presente en la composición en una proporción de desde el 0, 1% hasta el 99, 9%, preferiblemente desde el 1% hasta el 99%, más preferiblemente desde el 10% hasta el 90%.

13. Composición que comprende al menos una de las cepas bacterianas definidas en las reivindicaciones 6 a 10 junto con otra cepa o mezcla de cepas, en la que la mezcla comprende preferiblemente desde 2 hasta 6 cepas, más preferiblemente desde 2 hasta 4 cepas, lo más preferiblemente desde 2 hasta 3 cepas y en la que cada una de las cepas está presente en la composición en una proporción de desde el 0, 1% hasta el 99, 9%, preferiblemente desde el 1% hasta el 99%, más preferiblemente desde el 10% hasta el 90%.

14. Composición que comprende una cepa como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 o una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13 en forma liofilizada.

15. Composición que comprende una cepa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 o una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13 en forma congelada.

16. Composición que comprende una cepa como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 o una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13 en forma inactivada o muerta.

17. Producto alimenticio que comprende material de soporte y al menos una cepa según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, un cultivo, una composición o un producto según las reivindicaciones 11 y 12 a 16.

18. Producto según la reivindicación 17, en el que el material de soporte es una composición alimenticia seleccionada de leche, yogurt, cuajada, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, productos fermentados a base de carne, productos a base de cereales fermentados, polvos a base de leche, polvos a base de cereal, preparados para lactantes, preparado de nutrición clínica, helados, zumos, harinas, pan, pasteles, azúcar, caramelos o chicles.

19. Producto según la reivindicación 17, en el que la cepa microbiana según las reivindicaciones 6 a 10 está contenida en el material de soporte en una cantidad de desde

12

aproximadamente 10ufc/g hasta aproximadamente 10ufc/g de material de soporte, preferiblemente desde 6 11

aproximadamente 10ufc/g hasta aproximadamente 10ufc/g de material de soporte, más preferiblemente desde aproximadamente 106 ufc/g hasta aproximadamente 1010 ufc/g de material de soporte.

20. Composición farmacéutica que comprende al menos una cepa según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, un cultivo, una composición o un producto según las reivindicaciones 1 1 y 1 2 a 19 y excipientes farmacéuticamente aceptables.

21. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, en la que las cepas microbianas están contenidas en una cantidad

14

de desde 10ufc/g hasta 10ufc/g de material de soporte,

13

preferiblemente desde 10ufc/g hasta 10ufc/g de material

12

de soporte, más preferiblemente desde 10ufc/g hasta 10ufc/g de material de soporte.

22. Cepa de bacteria según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, un cultivo, una composición o un producto según las reivindicaciones 11 y 12 a 19 para tratamiento terapéutico o profiláctico.

23. Composición según la reivindicación 22, para administración tópica, oral, ocular, nasal, enteral, urogenital, vaginal o rectal.

24. Composición según la reivindicación 22, diseñada para administrarse a mujeres embarazadas para el tratamiento terapéutico o profiláctico de su feto.

25. Composición según la reivindicación 22, diseñada para administrarse a mujeres lactantes para el tratamiento terapéutico o profiláctico de sus bebés amamantados.

26. Uso de una cepa según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, un cultivo, una composición o un producto según las reivindicaciones 11 y 12 a 20 en la fabricación de un producto para el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades en seres humanos o animales.

27. Uso según la reivindicación 26, para el tratamiento y/o la profilaxis de la infección crónica o aguda, o de la colonización microbiana no deseada, en el que la infección

o colonización está provocada por parásitos, bacterias, levaduras, hongos o virus, de una superficie mucosa en un sujeto o animal que necesita el mismo, en el que la superficie mucosa se selecciona pero no se limita al grupo que consiste en la oral, nasofaríngea, respiratoria, gástrica, intestinal, urogenital y glandular.

28. Uso según la reivindicación 26, para el tratamiento y/o la profilaxis de niveles inmunitarios temporalmente deprimidos en individuos sometidos a estrés fisiológico.

29. Uso según la reivindicación 26, para la mejora de la barrera intestinal inmunitaria en un sujeto o animal que necesita la misma; para el tratamiento y/o la profilaxis de reacciones de hipersensibilidad reguladas por disminución frente a alimentos e intolerancia metabólica tal como: intolerancia a la lactosa; del estreñimiento y otros trastornos gastrointestinales; de trastornos inflamatorios

o autoinmunitarios tales como: EII (enfermedad inflamatoria del intestino) , colitis ulcerosa, artritis, aterosclerosis, esclerosis múltiple, psoriasis o sarcoidosis; y de crecimiento tumoral, metástasis y cáncer en un sujeto o animal que necesita el mismo.

30. Uso según la reivindicación 26, para el tratamiento y/o la profilaxis de trastornos alérgicos y asma en un sujeto o 5 animal que necesita el mismo.

31. Uso según la reivindicación 26, para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades neurodegenerativas en un individuo o animal que necesita el mismo, seleccionadas de, pero no limitadas a, el grupo que consiste en Parkinson,

accidente cerebrovascular, Alzheimer, Huntington y demencia.