Biochips con sondas y sus métodos de uso.

Kit que comprende:

(i) un biochip de sondas que comprende un soporte y al menos dos sondas sin marcar,

fijadas al soporte, quecomprenden

a) una secuencia específica de una diana, de 6 a 30 nucleótidos de longitud;

(b) un primer brazo de menos de 10 nucleótidos de longitud, situado en 5' de la secuencia específica de unadiana; y

(c) un segundo brazo de menos de 10 nucleótidos de longitud, situado en 3' de la secuencia específica deuna diana,

en donde la secuencia específica de la diana no es complementaria de ninguna otra parte de la sonda; en donde elprimer brazo y el segundo brazo son perfectamente complementarios entre sí; en donde los primeros brazos dedichas al menos dos sondas poseen una secuencia idéntica y las secuencias específicas de la diana de dichas almenos dos sondas, son diferentes;

(ii) una molécula "informadora" que comprende un marcador detectable y menos de 10 nucleótidosperfectamente complementarios con la secuencia de ácido nucleico del primer o del segundo brazo de la sonda, endonde dicha molécula "informadora" es capaz de hibridarse con el primer o el segundo brazo de la sonda cuandouna molécula diana se hibrida con la secuencia específica de la diana y la sonda adopta una conformación "abierta";y(iii) uno o varios reactivos adicionales.

Biochips con sondas y sus métodos de uso

La invención se refiere al campo de la utilización de sondas de polinucleótidos sin marcar, capaces de formar horquillas, a biochips que contienen dichas sondas y a métodos para su uso. La presente descripción también se refiere a métodos para la creación de tales sondas y biochips. Más particularmente, la descripción describe el uso de dichas sondas sin marcar y biochips para la manipulación y el análisis de secuencias de polinucleótidos y posiblemente de sus moléculas asociadas. La presente descripción también describe métodos para preparar y usar tales sondas y biochips para el análisis de mutaciones, la secuenciación, la detección de variantes por corte y empalme alternativas, el análisis de la expresión génica, el análisis de desequilibrios alélicos y la pérdida de heterocigosidad, y la detección de cualquier ácido nucleico presente en los organismos o los restos procedentes de estos organismos.

La determinación rápida y precisa de la identidad y la cantidad de moléculas específicas en una muestra que contiene muchas moléculas diferentes, es de interés principal en los campos de las aplicaciones médicas y biológicas. Muchos tipos de sondas y sistemas de análisis han sido desarrollados para detectar moléculas específicas, tales como las sondas y los chips para la detección de cambios en la secuencia de ácidos nucleicos.

Un tipo de sonda tal para detectar ácidos nucleicos específicos, puede ser un "interruptor molecular" similar al descrito en el documento de patente de EE.UU. nº 5.118.801, que funciona según el principio de la imposibilidad que tienen los extremos de la sonda para interaccionar entre sí, cuando la porción central de la sonda se hibrida con una secuencia diana. Cada interruptor molecular tiene 2 extremos complementarios que tienen una longitud de al menos 10 nucleótidos, y una porción central de aproximadamente 15 a 115 nucleótidos de longitud. Dependiendo de las condiciones de la prueba, la sonda descrita puede adoptar una conformación "cerrada" o "abierta". Cuando la sonda está en su conformación cerrada, los extremos de la sonda se hibridan entre sí para formar un "vástago", en donde la secuencia central forma un "bucle". En la conformación abierta, la secuencia central de la sonda se hibrida con una secuencia diana complementaria, predeterminada para la que se ha diseñado la sonda. Esta conformación abierta lleva a la disociación de los extremos de la sonda y a la imposibilidad de que estos extremos interaccionen entre sí. Uno o ambos extremos de la sonda descrita contienen una porción de ácido nucleico biológicamente funcional para generar selectivamente una señal detectable, indicativa de la hibridación de la sonda con la secuencia diana predeterminada. Una porción preferida es, por ejemplo, un ARN que permite una replicación exponencial gracias a una ARN polimerasa, dependiente de ARN, en presencia de nucleótidos radioactivos, incorporados en los productos de la replicación.

Otro tipo de sonda, comúnmente llamado "baliza molecular" es similar a la que se ha descrito anteriormente, y se describe en los documentos de patente de EE.UU. nº 5.925.517 y europea EP0745690 (véase también y col., 1996, Nat. Biotechnol. 14:303-308; Tyagi y col., 1998, Nat. Biotechnol. 16:49-53; Matsuo T. 1998, Biochimica Biophysica Acta. 1379:178-184; Sokol y col. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:11538-11543; Leone y col. 1998, Nucleic Acids Res. 26:2150-2155; Piatek y col. 1998, Nat. Biotechnol. 16:359-363; Kostrikis y col. 1998, Science 279:12281229; Giesendorf y col. 1998, Clin. Chem. 44:482-486; Marras y col. 1999 Genet. Anal. 14:151-156; Vet y col. 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6394-6399) . Las “balizas moleculares” son moléculas que poseen un fluoróforo interno extinguido en el que la fluorescencia se restaura cuando se unen a un ácido nucleico diana. Están diseñadas de manera similar a un interruptor molecular, de modo que la parte del bucle de la molécula constituye una secuencia de sonda complementaria de una molécula nucleico diana y la parte del vástago es el resultado del apareamiento de las secuencias de los "brazos" complementarios, situadas en los extremos de la secuencia de la sonda. Un grupo fluorescente se fija a un extremo de un brazo. Un grupo extintor se fija al extremo del otro brazo. En ausencia de una molécula diana, estos dos grupos están muy próximos entre sí, provocando la extinción del fluoróforo. Cuando la sonda se hibrida con un ácido nucleico diana que es perfectamente complementario, la “baliza molecular” sufre un cambio conformacional que obliga a los brazos del vástago a disociarse, haciendo así que el fluoróforo y el extintor se alejen uno de otro. Esto permite detectar la hibridación de la sonda con su molécula diana a través de la aparición de fluorescencia.

Actualmente, los sistemas de biochips son ampliamente utilizados para la detección y la medición de determinadas sustancias en muestras complejas. En tales sistemas, la identidad y la cantidad de una sustancia diana en una muestra se determinan midiendo el nivel de asociación de la secuencia diana con sondas diseñadas específicamente para esta secuencia diana. En las tecnologías de biochips de ácidos nucleicos, un conjunto de sondas de ácidos nucleicos, en donde cada una tiene una secuencia definida, se inmoviliza sobre un soporte sólido de tal forma que cada sonda ocupa una posición predeterminada. Una vez que el conjunto de sondas está inmovilizado, el chip, se pone en contacto con una muestra, de modo que las secuencias complementarias se puedan asociar a una sonda inmovilizada, por ejemplo, hibridándose, asociándose o uniéndose a la sonda. Después de retirar el material no asociado, las secuencias asociadas se detectan y se miden.

Las tecnologías de biochips de ADN han hecho posible el seguimiento de los niveles de expresión de un gran número de transcritos genéticos al mismo tiempo (véase, por ejemplo, Schena y col., 1995, Science 270:467-470; Lockhart y col., 1996, Nat. Biotechnology 14:1675-1680; Blanchard y col., 1996, Nat. Biotechnology 14:1649; Ashby y col., documento de patente de EE.UU. nº 5.569.588 expedida el 29 de octubre, 1996) . La tecnología de biochips también se ha utilizado para secuenciar, determinar las huellas genéticas y cartografiar macromoléculas biológicas (documentos de patente de EE.UU. nº 6.270.961 expedida el 7 de agosto, 2001; 6.025.136 expedida el 15 de febrero, 2000; 6.018.041 expedida el 25 de enero, 2000; 5.871.928 expedida el 16 de febrero, 1999; 5.695.940 expedida el 9 de diciembre, 1997) . Hay dos formatos principales de biochips de ADN. Para uno de esos formatos, los biochips de ADN se preparan depositando fragmentos de ADN que varían en tamaño desde unas pocas decenas de bases a unas pocas kilobases, sobre una superficie adecuada (véase, por ejemplo: DeRisi y col., 1996, Nature Genetics 14:457-460; Shalon y col., 1996, Genome Res. 6:689-645; Schena y col., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 93:10539-11286, y Duggan y col., 1996, Nature Genetics Suplemento 21:10-14) . Por ejemplo, en el análisis por "transferencia", como la transferencia de manchas "dot blot" o la hibridación de ADN/ADN sobre una membrana (Southern Blotting) , las moléculas de ácido nucleico se pueden separar previamente mediante el uso de, por ejemplo, una separación en función del tamaño en una electroforesis en gel, seguida por su transferencia y su inmovilización sobre una membrana filtrante, tal como una membrana de nitrocelulosa o nailon, seguido de su hibridación con una secuencia única marcada (véase, por ejemplo., Nicoloso, M. y col., 1989, Biochemical and Biophysical Research Communications 159:1233-1241; Vernier, P. y col., 1996, Analytical Biochemistr y 235:11-19) . Los biochips de ADN complementario (ADNc) se preparan depositando sobre una superficie adecuada los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (del inglés, “polymerase chain reaction”, PCR) que se presentan en forma de fragmentos de ADN complementarios, cuyo tamaño varía entre 0, 6 y 2, 4 kb, procedentes de ADNc, ESTs (marcador de secuencia expresada, del inglés, “Expressed Sequence Tag”) etc. (véase, por ejemplo: DeRisi y col., 1996, Nature Genetics 14:457-460; Shalon y col., 1996, Genome Res. 6:689-645; Schena y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10539-11286; y Duggan y col., 1996, Nature Genetics Suplemento 21:10-14) . El otro formato de biochips de ADN, denominado matrices de alta densidad de oligonucleótidos contienen miles de oligonucleótidos complementarios de secuencias definidas, que ocupan posiciones conocidas sobre la superficie utilizada. Estos oligonucleótidos... [Seguir leyendo]

1. Kit que comprende:

(i) un biochip de sondas que comprende un soporte y al menos dos sondas sin marcar, fijadas al soporte, que comprenden

(a) una secuencia específica de una diana, de 6 a 30 nucleótidos de longitud;

(b) un primer brazo de menos de 10 nucleótidos de longitud, situado en 5' de la secuencia específica de una diana; y

(c) un segundo brazo de menos de 10 nucleótidos de longitud, situado en 3' de la secuencia específica de una diana,

en donde la secuencia específica de la diana no es complementaria de ninguna otra parte de la sonda; en donde el primer brazo y el segundo brazo son perfectamente complementarios entre sí; en donde los primeros brazos de dichas al menos dos sondas poseen una secuencia idéntica y las secuencias específicas de la diana de dichas al menos dos sondas, son diferentes;

(ii) una molécula “informadora” que comprende un marcador detectable y menos de 10 nucleótidos perfectamente complementarios con la secuencia de ácido nucleico del primer o del segundo brazo de la sonda, en donde dicha molécula “informadora” es capaz de hibridarse con el primer o el segundo brazo de la sonda cuando una molécula diana se hibrida con la secuencia específica de la diana y la sonda adopta una conformación “abierta”; y

(iii) uno o varios reactivos adicionales.

2. Kit de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia específica de la diana tiene una longitud de 10-25 nucleótidos, preferentemente de 15-20 nucleótidos.

3. Kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la Dtm (diferencia entre la temperatura de fusión (Tm) del híbrido perfecto formado entre la secuencia específica de la diana de la sonda y la molécula diana, y la temperatura de fusión (Tm) del híbrido formado entre el primer brazo y el segundo brazo de la sonda) , es superior a 10, preferentemente igual a 15.

4. Kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la Dtm (diferencia entre la temperatura de fusión (Tm) del híbrido perfecto formado entre la secuencia específica de la diana de la sonda y la molécula diana, y la temperatura de fusión (Tm) del híbrido formado entre el primer brazo y el segundo brazo de la sonda) , es inferior a 10.

5. Kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicha sonda comprende además un espaciador y está fijada a dicho soporte con dicho espaciador.

6. Kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el soporte consiste en una superficie de vidrio funcionalizada, una superficie de plástico funcionalizada, una superficie metálica funcionalizada, una superficie conductora de metal, una superficie conductora de plástico, un soporte poroso, un metal poroso, una fibra óptica, un soporte obtenido a partir de fibra de vidrio, dióxido de silicio, una membrana lipídica funcional, un liposoma, una membrana de filtración o perlas o partículas de tamaño inferior a una micra.

7. Kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque una misma molécula “informadora” se puede hibridar con cada sonda.

8. Kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque todos los híbridos perfectos formados entre las secuencias específicas de la diana de las sondas y las moléculas diana tienen una temperatura de fusión igual, dentro de un intervalo de 4ºC, preferentemente dentro de un intervalo de 1ºC.

9. Kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la diferencia entre la temperatura de fusión del híbrido formado entre la secuencia específica de la diana de cada sonda y la molécula diana, y la temperatura de fusión para la asociación entre la secuencia específica de la diana y una molécula para la que no se ha diseñado la secuencia específica de la diana de la sonda, es superior o igual a 5ºC, preferentemente superior o igual a 8ºC.

10. Kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque las Dtm de al menos dos sondas (diferencia entre la temperatura de fusión (Tm) del híbrido perfecto formado entre la secuencia específica de la diana de la sonda y la molécula diana, y la temperatura de fusión (Tm) del híbrido formado entre el primer brazo y el segundo brazo de la sonda) , son iguales, dentro de un intervalo de 1ºC.

11. Kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además un conjunto de sondas sin marcar y sin inmovilizar que comprende:

(a) una secuencia específica de una diana, de 6 a 30 nucleótidos de longitud;

(b) un primer brazo de menos de 10 nucleótidos de longitud, situado en 5' de la secuencia específica de una diana; y

(c) un segundo brazo de menos de 10 nucleótidos de longitud, situado en 3' de la secuencia específica de una diana,

en donde la secuencia específica de la diana no es complementaria de ninguna otra parte de la sonda; el primer brazo y el segundo brazo son completamente complementarios entre sí.

12. Kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque el marcador detectable es un análogo de nucleótido, un marcador fluorescente, biotina, iminobiotina, un antígeno, un cofactor, dinitrofenol, ácido lipoico, un compuesto olefínico, un polipéptido, una molécula rica en electrones, una enzima o un radioisótopo.

13. Método de detección de ácido nucleico que comprende:

(a) poner en contacto ex vivo una muestra de ácido nucleico con un biochip tal como el definido en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12; y

(b) detectar una señal que proviene de al menos una sonda del biochip que ha adoptado una conformación abierta después del contacto establecido durante la etapa (a) con ayuda de una molécula “informadora” tal como se define en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Método de detección ex vivo de una variante genética en una muestra de ácido nucleico que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un biochip tal como el definido en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque al menos una sonda del biochip es una sonda específica de una variante genética, y

(b) detectar una señal que proviene de la sonda específica de la variante genética con ayuda de una molécula “informadora” tal como se define en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la señal detectada en la etapa (b) indica la presencia de una variante genética en la muestra de ácido nucleico.

15. Método de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque la variante genética detectada es un polimorfismo de un solo nucleótido.

16. Método de detección ex vivo de cualquier organismo que contenga ácido nucleico o de cualquier resto de esos organismos, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de ácido nucleico con un biochip tal como el definido en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, en donde al menos una de dichas sondas es una sonda específica de ácido nucleico de un organismo o de restos de ese organismo; y

(b) detectar una señal que proviene de la sonda específica de ácido nucleico de un organismo con ayuda de una molécula “informadora” tal como se define en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12,

en donde la señal detectada en la etapa (b) indica la presencia del organismo que contiene el ácido nucleico o restos de ese organismo.

17. Método de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque el organismo que contiene los ácido nucleico es un virus o una bacteria.

18. Método de detección ex vivo de un producto del corte y empalme alternativo de un gen en una muestra de ácido nucleico, que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un biochip tal como se ha definido en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque al menos una sonda del biochip es una sonda de horquilla específica de un exón de un gen o de la unión de dos exones; y

(b) detectar una señal que proviene de la sonda específica del exón o de la unión de dos exones, con ayuda de una molécula “informadora” tal como se ha definido en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la señal detectada en la etapa (b) indica la presencia del producto de

corte y empalme alternativo de un gen en la muestra de ácido nucleico.

19. Método de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque la muestra de ácido nucleico comprende ARNm o ADNc.

20. Un método de secuenciación ex vivo de un oligonucleótido que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que contiene el oligonucleótido con un biochip tal como se ha definido en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12; y

(b) detectar una señal que proviene de al menos una sonda del biochip con ayuda de una molécula “informadora” tal como se ha definido en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12;

en donde la señal detectada en la etapa (b) se utiliza para determinar la secuencia del oligonucleótido.

21. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 a 20, en donde la muestra de la etapa (a) está marcada previamente con un marcador detectable.

22. Método de detección ex vivo de desequilibrios alélicos y pérdidas de heterocigosidad en una muestra de ácido nucleico que comprende:

(a) amplificar al menos una región de ADN cromosómico de tipo microsatélite mediante una pareja de cebadores a partir de al menos dos muestras de ácido nucleico procedentes de tejidos o fluidos biológicos, en donde al menos una de las muestras procede de células o de tejidos que no presentan ningún desequilibrio alélico o pérdida de heterocigosidad, y en donde cada tejido o fluido está marcado de manera diferente durante la amplificación;

(b) eliminar esos cebadores después de la amplificación;

(c) poner en contacto dichos productos de la amplificación con un biochip tal como se ha definido en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12, en donde al menos una sonda del biochip es complementaria de un cebador utilizado para amplificar dicha región de ADN cromosómico; y

(d) detectar señales procedentes de al menos una sonda de dicho biochip con ayuda de una molécula “informadora” tal como la que se ha definido en el kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 12;

en donde las señales detectadas en la etapa (d) se utilizan para determinar la presencia de un desequilibrio alélico o una pérdida de heterocigosidad en una de las muestras de ácido nucleico.