La presente invención consiste en una aplicación biotecnológica del gen RAV1 (Related to ABI3 and Viviparous 1) y su homólogo RAV2 en relación a su capacidad,

cuando se modifican sus niveles de expresión o bien la actividad de las proteínas que codifican, para incrementar o disminuir el desarrollo de ramas silépticas y/o prolépticas en especies leñosas. Mediante la modificación de la expresión de dichos genes es posible aumentar la producción de biomasa de una plantación de especies leñosas, o bien reducir el número de nudos en el tronco de especies leñosas de interés maderero.

PROCEDIMIENTO PARA AUMENTAR O DISMINUIR EL DESARROLLO DE

RAMIFICACIÓN SILÉPTICA Y/O PROLÉPTICA EN UNA PLANTA LEÑOSA

5 SECTOR TÉCNICO

La invención se encuadra en los sectores técnicos de la biotecnología y la explotación forestal con finalidades energéticas, químicas o madereras.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las plantaciones en turnos cortos (Short Rotation Forestr y , SRF) de especies forestales de crecimiento rápido bajo un sistema de manejo intensivo representan una de las fuentes de biomasa más interesantes. Las principales especies explotadas con este modelo son el chopo (Populus spp.) , el eucalipto (Eucalyptus spp.) o el sauce (Salix spp.) , con un turno de tala entre los 2 y 10 años. Por un lado, la biomasa

lignocelulósica es apta para producir biocarburantes en forma de combustibles líquidos

o gaseosos para el transporte, y biolíquidos o combustibles líquidos destinados a usos energéticos distintos del transporte, como la producción de electricidad o calor. Por otro lado, este tipo de plantaciones forestales pueden establecerse en terrenos marginales o agrícolas excedentarios, por lo que no compiten de un modo directo con

el cultivo alimentario por los suelos fértiles. Sin embargo, su rendimiento con fines bioenergéticos sigue siendo objeto de mejora, ya que es todavía un factor limitante importante que las aleja de ser económica y comercialmente viables.

El rendimiento de biomasa lignocelulósica es un rasgo genético altamente complejo.

Constituye el resultado integrado y combinado de otros tantos rasgos complejos, cada uno de ellos controlado a su vez por varios genes. Entre estos rasgos se encuentran, por ejemplo, la altura del árbol, el diámetro del tronco, el número y área de las hojas o el número de ramas. En los últimos años, algunos equipos de investigación han abordado el problema a través de la identificación de las regiones genómicas

implicadas en la regulación de estos rasgos en especies leñosas mediante el mapeo de QTL (Quantitative Trait Loci) . En este sentido, el trabajo de Rae et al. (Five QTL hotspots for yield in short rotation coppice bioenergy poplar: the Poplar Biomass Loci. BMC Plant Biology 2009, vol. 9, p. 23) realizado con una familia de 320 genotipos del híbrido Populus trichocarpa x P. deltoides cultivados en turnos cortos resulta

35 especialmente interesante. En este trabajo se identifican cinco QTLs responsables del 20% de la variación entre estos genotipos en cuanto al rendimiento de biomasa. Además se describen las correlaciones positivas existentes entre diámetro y área basales de tallos y ramas a partir del primer año y su rendimiento de biomasa en ese año y en los años siguientes hasta cinco, y entre el número de ramas silépticas que crecen en el primer año y el diámetro y área basales de tallos y ramas a partir del primer año. En la mayoría de especies leñosas en latitudes templadas, las yemas laterales no brotan durante la misma estación en que se forman. Estas yemas, las prolépticas, deben pasar el invierno para poder brotar y formar ramas en la siguiente primavera. Las yemas silépticas, en cambio, que aparecen sobre todo durante la etapa juvenil del árbol, no necesitan de los fríos invernales para su desarrollo en ramas.

Por lo tanto la ramificación siléptica no solo incrementa significativamente el crecimiento general del chopo, sobre todo durante los primeros años, sino que también se perfila como un rasgo valioso que permite predecir tempranamente el rendimiento final de biomasa de una plantación.

El gen RAV1 (Related to ABI3 and Viviparous 1) pertenece a la familia de factores de transcripción RAV, caracterizada por la presencia en su estructura primaria de los dominios de unión a DNA AP2/EREBP (Apetala2/Ethylene Response Element Binding Factor) y B3 (Kagaya et al., RAV1, a novel DNA-binding protein, binds to bipartite recognition sequence through two distinct DNA-binding domains uniquely found in higher plants. Nucleic acids research 1999, vol. 27, p. 470-478; Yamasaki et al., Solution structure of the B3 DNA binding domain of the Arabidopsis cold-responsive transcription factor RAV1. The plant cell 2004, vol. 16, p. 3448–3459) . Según la literatura, en la planta herbácea Arabidopsis thaliana los genes RAV1 (AtRAV1; AT1G13260) y RAV2 (AtRAV2/TEM2; AT1G68840) estarían implicados en la respuesta al frío independiente de ácido abscísico (Sakuma et al., DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible gene expression. Biochemical and biophysical research communications 2002, vol. 290, p. 998-1009) y en la respuesta a otros estímulos externos como los mecánicos (Kagaya and Hattori, Arabidopsis transcription factors, RAV1 and RAV2, are regulated by touch-related stimuli in a dose-dependent and biphasic manner. Genes and genetic systems 2009, vol. 84, p. 95-99) . AtRAV1 actuaría además como regulador negativo en el desarrollo de raíces laterales y hojas de la roseta así como, junto con los genes TEMPRANILLO1 (TEM1; AT1G25560) y AtRAV2/TEM2, en el tiempo de floración (Hu et al., Arabidopsis RAV1 is downregulated by brassinosteroid and may act as a negative regulator during plant development. Cell research 2004, vol. 61, p. 3947-3947; Castillejo and Pelaz, The balance between CONSTANS and TEMPRANILLO activities determines FT expression to trigger flowering. Current biology 2008, vol. 18, p. 1338-1343) . También se ha descrito a AtRAV1 como regulador positivo en el proceso de senescencia de las hojas (Woo et al., The RAV1 transcription factor positively regulates leaf senescence in Arabidopsis. Journal of experimental botany 2010, vol. 61, p. 3947-3957) . Por otro lado en tomate (Solanum lycopersicum) , el gen RAV2 modula la respuesta de defensa a la bacteria patógena Ralstonia solanacearum (Li et al., Tomato RAV transcription factor is a pivotal modulator involved in the AP2/EREBP-mediated defense pathway. Plant Physiology 2011, vol. 156, p. 213-227) . En estos trabajos se ha relacionado la función de los genes AtRAV1 (Hu et al., 2004) , TEM1 y AtRAV2/TEM2 (Castillejo and Pelaz, 2008) de A. thaliana con el control de aspectos del crecimiento y el desarrollo distintos a la regulación de la ramificación, ya que la manipulación de su expresión en esta especie herbácea no causa un mayor número de ramas. Sin embargo, ninguna de estas publicaciones del arte relaciona el gen RAV1 con la regulación del desarrollo de la ramificación en ninguna especie leñosa.

La solicitud WO 2006/132616 A1 describe la función reguladora de los genes RAV1 y RAV2 en el silenciamiento génico en plantas. Esta patente tiene un interés genérico en la tecnología de la manipulación genética de plantas, pero no se relaciona su objeto de protección con los procesos del desarrollo controlados por dichos genes RAV ni con la productividad vegetal.

Por otra parte, la supresión de la expresión de los genes RAV1 y RAV2 debería inhibir la aparición de ramas y ocasionar un número menor de nudos en el tronco del árbol, con lo que se obtendrían maderas de alta calidad. La inhibición de ramificación siléptica y/o proléptica se revela así como una posible herramienta de gran valor comercial.

El problema que se plantea entonces en la técnica es conseguir de forma eficaz una modificación de la cantidad o calidad de la producción de madera de una planta leñosa, según se necesite, para incrementar el beneficio de sus productos derivados. La solución que propone la presente invención es modificar por procedimientos técnicos la expresión de los genes RAV1 y RAV2 en dicha planta leñosa e influir así en su producción de ramificación siléptica y/o proléptica.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe una modificación genética aplicable a especies leñosas que permite modificar el desarrollo de ramas silépticas desde muy temprana edad de las plantas.

Consiste en una aplicación biotecnológica del gen RAV1 (Related to ABI3 and Viviparous 1) y su homólogo RAV2 en relación a su capacidad, cuando se modifican sus niveles de expresión, o bien la actividad de las proteínas codificadas por ellos, para aumentar o disminuir el grado de desarrollo de ramificación siléptica y/o proléptica en una especie leñosa.

Una primera realización de la invención es, por tanto, un procedimiento para aumentar

o disminuir el desarrollo...

REIVINDICACIONES?

º Ea gen CsRAVº aisaado de Castanea sativa Miller identificado por aa SEQ 10 NO: , capaz de aumentar o disminuir ea desarroaao de ramificación siaeptica y/o proaeptica 5 en una paanta aefosa respecto a aa variedad siavestre de dicha paanta

º Ea CsRAVº aisaado de Castanea sativa Miller segun aa reivindicación , identificado por una secuencia con aa menos un 9º , % de identidad respecto a SEQ 10 NO: º La proteina obtenida en aa expresión de CsRAV1 identificada por aa SEQ 10 NO: º 4 Vector de expresión que comprende ea gen CsRAV1 y ea promotor CaMVº5S, o 10 sus derivados funcionaaes 5 ºaanta aefosa con aa menos un poainucae6tido codificante de CsRAVº, o sus

anaaogos funcionaaes, integrado de forma estabae en ea genoma de aas ceauaas º Ceauaa de paanta aefosa con aa expresión de RAVº y/o RAVº modificada º ºaanta aefosa transgenica con aa expresión de RAVº y/o RAVº modificada

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