ANTÍGENOS DE FUSIÓN DE MÚLTIPLES EPÍTOPOS DE VHC CON SITIOS PARA ESCISIÓN PROTEOLÍTICA MODIFICADOS Y USOS DE LOS MISMOS.

Antígenos de fusión de múltiples epítopos del VHC con sitios para escisión proteolítica modificados y usos de los mismos Campo de la técnica La presente revelación se refiere a, en general, construcciones del virus de la hepatitis C (VHC) y a procedimientos de uso de los mismos. Más particularmente, la invención se refiere a antígenos de fusión con múltiples epítopos (MEFA) inmunogénicos del VHC que contienen múltiples epítopos del VHC, con secuencias de aminoácidos modificadas para inhibir la escisión proteolítica del MEFA por NS3. Las proteínas son útiles en inmunoensayos para el diagnóstico de la infección por VHC. Antecedentes de la invención El VHC es un virus con cubierta con un genoma de ARN monocatenario de hebra positiva de aproximadamente 9,5 kb que codifica aproximadamente 3010 aminoácidos (Choo y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA (1991) 88:2451-2455; Takamizawa y col., J. Virol. (1991) 65:1105-1113). La poliproteína del VHC es procesada por el huésped y las proteasas virales y se convierte en varias proteínas maduras: la proteína del núcleo (C ), las glicoproteínas de la cubierta (E1 y E2) y seis proteínas no estructurales (NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b) (Hijikata y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:10773-10777; Grakoui y col., J. Virol. (1993) 67:1385-1395). NS3 es una proteína de 630 aminoácidos con tres actividades enzimáticas: Los aproximadamente 180 aminoácidos en N-terminal proporcionan la función de serina proteasa, mientras que los restantes dominios en C-terminal tienen tanto actividad helicasa como NTPasa (Bartenschlager y col., J. Virol. (1993) 67:3835-3844; Kim y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1995) 215:160-166; Preugschat y col., J. Biol. Chem. (1996) 271:24449-24457). La proteasa NS3 es responsable de las escisiones en los sitios de unión NS3/4a, NS4a/4b, NS4b/5a y NS5a/5b (Grakoui et al., J. Virol. (1993) 67:2832-2843). NS4a incluye aproximadamente 54 aminoácidos y actúa como cofactor de la proteasa NS3 y es esencial para el procesamiento de la poliproteína (Failla y col., J. Virol (1994) 68:3753-3760). El VHC es el principal agente etiológico de hepatitis viral no A no B asociada con transfusión de sangre y adquiridas extrahospitalariamente (Alter y col., N. Engl. J. Med. (1989) 321:1494-1500; Choo y col., Science (1989) 244:359-362; Kuo y col., Science (1989) 244:362-364). Actualmente, el VHC afecta a aproximadamente un 3 % de la población mundial. El 70 % de estos individuos desarrolla infección crónica por VHC, que a menudo progresa a cirrosis hepática y carcinomas hepatocelulares (Bruix y col., Lancet (1989) 2:1004-1006; Saito y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6547-6549). La incidencia del VHC postransfusional ha disminuido de forma constante desde la implementación de la detección selectiva de rutina de los anticuerpos frente al VHC entre donantes sanguíneos (Pillonel y col., Transfusion (2002) 42:980- 988). A pesar de la demostrada utilidad de estos ensayos para la detección selectiva en sangre y para el diagnóstico de infección por VHC en pacientes sintomáticos siguen existiendo importantes retos para la mejora del rendimiento del ensayo. Dichos retos incluyen reducir la ventana de seronegatividad, mejorar la detección de las muestras de VHC de pacientes con inmunosupresión e incrementar la sensibilidad del ensayo para detectar anticuerpos frente a diferentes epítopos específicos de genotipo del VHC. Se han desarrollado varios ensayos para el serodiagnóstico de la infección por VHC. Véase, por ejemplo, Choo y col., Science (1989) 244:359-362; Kuo y col., Science (1989) 244:362-364; Choo y col., Br. Med. Bull. (1990) 46:423-441; Ebeling y col., Lancet (1990) 335:982-983; van der Poel y col., Lancet (1990) 335:558-560; van der Poel y col., Lancet (1991) 337:317-319; Chien, D.Y., publicación internacional Nº WO 94/01778; Valenzuela y col., publicación internacional Nº WO 97/44469; y Kashiwakuma y col., patente de EE.UU. nº 5.871.904. Los ensayos de anticuerpos ELISA para VHC actualmente aprobados usan principalmente proteínas recombinantes que contienen epítopos lineales. Por ejemplo, en uno de los ensayos para VHC disponibles comercialmente se usan tres proteínas recombinantes del núcleo del VHC (C22-3), las regiones NS3 y NS4 (C200) y NS5 (Uyttendaele y col., Vox Sang. (1994) 66:122-129). La patente de EE.UU. nº 6.632.601 describe inmunoensayos usando epítopos conformacionales NS3/4a en combinación con antígenos de fusión de múltiples epítopos (MEFA). Para una descripción de los MEFA del VHC, véase, por ejemplo, Chien et al., J. Clin. Microbiol. (1999) 37: 1393-1397; publicación internacional nº WO 97/44469; las patentes de EE.UU. nº 6.514.731, 6.428.792; 6.632.601; y la publicación de patente de EE.UU. nº 20040142321. Los ensayos que usan estos reactivos proporcionan procedimientos sensibles y fiables para detectar la seroconversión temprana del VHC. NS3/4a, expresada en levaduras y purificada en condiciones no desnaturalizantes, tal como se describe en la patente de EE.UU. nº 6.632.601, contiene las funciones de proteasa y helicasa. Dado que la NS3/4a purificada de este modo conserva la conformación nativa, se ha descubierto que es más sensible que los antígenos c200 o c33c en la detección de anticuerpos de seroconversión temprana. En los ensayos de anticuerpos con NS3/4a y MEFA 7.1 como antígenos, se detectaron anticuerpos de seroconversión 2-14 días antes que los ensayos para VHC comercializados en la actualidad. No obstante, la proteína NS3/4 sufre autohidrólisis y también escinde el MEFA 7.1 debido a la actividad de NS3 proteasa. Las publicaciones internacionales nº WO 04/00547 y WO 01/38360, y la solicitud de patente provisional de propiedad 2   común nº 60/604,85 8, describen proteínas del VHC que incluyen dominios mutados de NS3 proteasa con menor actividad proteolítica. No obstante, sigue existiendo la necesidad de herramientas diagnósticas y pronósticas sensibles y precisas con el fin de proporcionar una adecuada atención al paciente, además de para prevenir la transmisión del VHC mediante sangre y productos hemoderivados o mediante contacto personal estrecho. Resumen de la invención La presente invención proporciona un antígeno modificado de fusión de múltiples epítopos (MEFA) del virus de la hepatitis C (VHC), en el que dicho MEFA comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia contigua de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 4, con la condición de que los aminoácidos en las posiciones 466, 467, 493, 494, 695, 696, 721, 722, 770, 771, 819 y 820, numeradas con respecto a la SEC ID Nº 4, mantengan los aminoácidos en las correspondientes posiciones de la SEC ID Nº 4. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los MEFA con sitios de escisión mutados para la NS3 proteasa son capaces de detectar infección por VHC. Los MEFA modificados de VHC son inmunorreactivos y son menos susceptibles a la escisión proteolítica mediante la NS3 proteasa del VHC. Por tanto, los MEFA se pueden usar en inmunoensayos en combinación con polipéptidos adicionales del VHC, tal como polipéptidos del VHC que conservan la actividad proteolítica del NS3. En una realización representativa de la invención, el MEFA modificado se usa en combinación con un epítopo conformacional NS3/4a en un soporte sólido de inmunoensayo. Los MEFA de la invención no se degradan durante la producción de los componentes del inmunoensayo y, por tanto, proporcionan reactivos superiores para usar en los ensayos del VHC. El uso de MEFA proporciona las ventajas de disminución de problemas de enmascaramiento, mejora de la selectividad y mejora de la sensibilidad para detectar anticuerpos permitiendo un mayor número de epítopos en una unidad de área de sustrato. Los ensayos descritos en el presente documento se pueden usar para detectar infección por VHC producida por cualquiera de los seis genotipos conocidos del VHC. También se divulgan en el presente documento un antígeno de fusión de múltiples epítopos (MEFA) modificado del VHC, en el que el MEFA comprende al menos un epítopo del dominio de la helicasa del VHC que comprende un sitio de escisión proteolítica de NS3 del VHC y al menos un epítopo de una región de NS4 que comprende un sitio de escisión proteolítica de NS3 del VHC, en el que los sitios de escisión proteolítica de NS3 del VHC presentes en el epítopo del dominio de la helicasa y el epítopo del NS4 están mutados, de un modo tal que la escisión proteolítica del MEFA modificado por NS3 está inhibida con respecto a la escisión proteolítica de un MEFA correspondiente que carece de mutaciones, y en el que, adicionalmente, el MEFA modificado reacciona específicamente con anticuerpos anti-VHC presentes en una muestra biológica de un individuo infectado por VHC.... [Seguir leyendo]

1. Un antígeno modificado de fusión de múltiples epítopos (MEFA) del virus de la hepatitis C (VHC), en el que dicho MEFA comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia contigua de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 4, con la condición de que los aminoácidos en las posiciones 466, 467, 493, 494, 695, 696, 721, 722, 770, 771, 819 y 820, numeradas con respecto a la SEC ID Nº 4, mantengan los aminoácidos en las correspondientes posiciones de la SEC ID Nº 4. 2. El MEFA modificado de la reivindicación 1, comprendiendo dicho MEFA una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 90 % con la secuencia contigua de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 4. 3. El MEFA modificado de la reivindicación 1, comprendiendo dicho MEFA una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 98% con la secuencia contigua de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 4. 4. El MEFA modificado DE la reivindicación 1, comprendiendo dicho MEFA la secuencia contigua de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 4. 5. Un soporte sólido para inmunoensayo que comprende el MEFA modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4. 6. El soporte sólido de inmunoensayo de la reivindicación 5, que comprende además al menos un epítopo conformacional NS3/4a del VHC, en el que dicho epítopo conformacional NS3/4a reacciona específicamente con anticuerpos anti-VHC presentes en una muestra biológica de un individuo infectado por VHC. 7. Un procedimiento para producir un soporte sólido para inmunoensayo, que comprende: (a) proporcionar un soporte sólido; y (b) unir al soporte sólido al menos un MEFA modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4. 8. El procedimiento de la reivindicación 7, que además comprende unir al soporte sólido en una posición discreta un epítopo conformacional NS3/4a del VHC, en el que el epítopo conformacional reacciona específicamente con anticuerpos anti-VHC presentes en una muestra biológica de un individuo infectado por VHC. 9. El procedimiento de la reivindicación 8 o el soporte sólido para inmunoensayo de la reivindicación 6, en el que el epítopo conformacional NS3/4a comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 80% con la secuencia contigua de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 6. 10. El procedimiento de la reivindicación 8 o el soporte sólido para inmunoensayo de la reivindicación 6, en el que el epítopo conformacional NS3/4a comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 90% con la secuencia contigua de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 6. 11. El procedimiento de la reivindicación 8 o el soporte sólido para inmunoensayo de la reivindicación 6, en el que el epítopo conformacional NS3/4a comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 98% con la secuencia contigua de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 6. 12. El procedimiento de la reivindicación 8 o el soporte sólido para inmunoensayo de la reivindicación 6, en el que el epítopo conformacional NS3/4a comprende la secuencia contigua de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 6. 13. El procedimiento de la reivindicación 8 o el soporte sólido para inmunoensayo de la reivindicación 6, en el que el epítopo conformacional NS3/4a consiste en la secuencia de aminoácidos representada en la SEC ID Nº 6. 14. Un procedimiento de detección infección por el virus de la hepatitis C (VHC) en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento: (a) proporcionar un soporte sólido para inmunoensayo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 o 9-13; (b) combinar una muestra biológica con dicho soporte sólido en condiciones que permitan que los anticuerpos del VHC, cuando estén presentes en la muestra biológica, se unan a dicho MEFA y a dicho epítopo conformacional NS3/4a si está presente, para formar un primer complejo inmunitario. (c) añadir al soporte sólido de la etapa (b) en condiciones formadoras de complejo un anticuerpo marcado de forma que se pueda detectar, en el que el anticuerpo marcado reacciona con dicho complejo inmunitario; (d) detectar segundos complejos inmunitarios formados entre el anticuerpo marcado de forma que se pueda detectar y el primer complejo inmunitario, si existe, como indicación de infección por VHC en la muestra biológica. 15. Un kit de ensayo para inmunodiagnóstico que comprende el soporte sólido para inmunoensayo de cualquiera de las   reivindicaciones 5, 6 o 9-13, e instrucciones para realizar el ensayo para inmunodiagnóstico. 16. Un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora para el MEFA modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4. 17. Un vector recombinante que comprende: (a) un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 16; (b) y elementos de control unidos operativamente a dicho polinucleótido de modo que la secuencia codificadora se pueda transcribir y traducir en una célula huésped. 18. Una célula huésped transformada con el vector recombinante de la reivindicación 17. 19. Un procedimiento para producir un MEFA recombinante, que comprende: (a) proporcionar una población de células huésped de acuerdo con la reivindicación 18; y (b) cultivar dicha población de células en condiciones mediante las cuales se expresa el antígeno de fusión de múltiples epítopos codificado por la secuencia codificadora presente en dicho vector recombinante. 61   62   63   64     66   67   68   69     71   72   73   74     76   77   78   79     81   82   83   84     86   87   88   89     91   92   93   94