ANTÍGENO RECOMBINANTE DE LA GARRAPATA ORNITHODOROS MOUBATA.
Antígeno recombinante de la garrapata Ornithodoros noubata.
La presente invención se refiere a unas secuencias aminoacídicas útiles para la detección de Ornithodoros moubata,
al método de detección de O. moubata en muestras biológicas utilizando como proteína de detección las secuencias aminoacídicas de la presente invención, a un kit para llevar a cabo dicho método y, finalmente, a un kit para la producción de las secuencias aminoacídicas de forma recombinante.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201030847.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: PÉREZ SÁNCHEZ,RICARDO, OLEAGA PÉREZ,ANA, SILES LUCAS,MAR, DÍAZ MARTÍN,VERÓNICA, MANZANO ROMÁN,RAÚL.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K39/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53).
- A61P25/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › Medicamentos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso.
- A61P31/12 A61P […] › A61P 31/00 Antiinfecciosos, es decir antibióticos, antisépticos, quimioterápicos. › Antivirales.
- C07K14/435 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de animales; de humanos.
PDF original: ES-2388026_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Antígeno recombinante de la garrapata Ornithodoros moubata.
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biomedicina, en concreto, la presente invención se refiere a unas secuencias aminoacídicas útiles para la detección de Orníthodoros moubata, al método de detección de
O. moubata en muestras biológicas utilizando como proteína de detección las secuencias aminoacídicas de la presente invención, a un kit para llevar a cabo dicho método y, finalmente, a un kit para la producción de las secuencias aminoacídicas de forma recombinante.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Las garrapatas son artrópodos hematófagos de importancia médica y veterinaria no sólo por los daños directos que provocan al hospedador (reacciones alérgicas, parálisis, destrucción de tejidos, etc.) sino también porque son vectores de microorganismos patógenos para animales y humanos.
Orníthodoros moubata es una garrapata perteneciente a la familia de los argásidos, que se distribuye por el sur, este y centro del continente africano y la isla de Madagascar colonizando hábitats silvestres y domésticos. En la naturaleza sus principales hospedadores son los facoceros, mientras que en el medio doméstico y peridoméstico sus principales hospedadores son los cerdos y los humanos (Hoogstral, 1956. Department of Medica/ Zoology, U.S. Nave/ Medica/ Research Unít No. 3. Caíro, Egypt; Roger et al., 2001. Exp. Appl. Acarol. (25) 263-269) .
Este ectoparásito transmite, entre otros patógenos, Borrelía duttoní, una espiroqueta que produce la Fiebre recurrente humana endémica de África oriental. Esta enfermedad afecta sobre todo a niños y mujeres embarazadas y produce altas tasas de mortalidad perinatal (Cutler, 2006. Emer. lnfec. Oís. (12) 369-374) . O. moubata también transmite el virus de la Peste porcina africana, una enfermedad altamente contagiosa en cerdos domésticos con un amplio rango de presentaciones clínicas que van desde la forma hiperaguda letal hasta la crónica y la inaparente (Basto et al., 2006. J. Gen. Viro/. (87) 1863-1871 ) , así como varios virus productores de encefalitis, pertenecientes a la familia Flavívírídae, como el virus del Nilo Occidental (West Nile) (Lawrie et al., 2004. Emerg lnfect Oís. 1O (4) 653-657) y los virus Karshí y Langat (Turrel et al., 2004. J Med Entamo/. 41 (5) 973-977) .
Para facilitar la prevención y control de las enfermedades que transmite, seria necesario eliminar O. moubata de, al menos, el medio doméstico y peridoméstico (viviendas humanas, dependencias animales, etc.) .
La erradicación de esta garrapata de dicho medio requiere el conocimiento detallado de los lugares en los que se encuentra para aplicar en ellos las oportunas medidas de control anti-garrapata (por ejemplo, acaricidas) . Para ello, el primer paso es detectar las zonas donde se encuentra la garrapata, para poder posteriormente, aplicar en ellos los correspondientes controles.
Teniendo en cuenta que la detección de las zonas donde se encuentra la garrapata no sería viable mediante la búsqueda directa del parásito en el terreno, pues es un proceso laborioso que exige de una inspección minuciosa de todos los agujeros y grietas que puedan servir de refugio a la garrapata en cada granja, o zona en estudio, antes de poder declarar dicha granja libre del parásito, es necesario la búsqueda de otros procedimientos alternativos que den lugar a estudios epidemiológicos a media o gran escala.
Una alternativa a la búsqueda directa de la garrapata es el desarrollo de métodos serológicos de detección de las granjas infestadas con O. moubata. Estos métodos estarían basados en la detección de anticuerpos específicos frente a la garrapata en muestras de suero tomadas a los animales de las granjas del área de estudio.
Es conocido que la saliva de las garrapatas contiene diversas moléculas capaces de modificar la fisiología de sus hospedadores, por lo que debido al importante papel biológico que juega este fluido, se han desarrollado distintos métodos serológicos destinados a detectar O. moubata utilizando como antígeno SGE, un extracto de proteínas de las glándulas salivares de esta garrapata (Baranda et al., 2000. Vet. Parasítol. (87) 193-206)
A pesar de que las pruebas desarrolladas en animales infestados experimentalmente en laboratorio indican que el SGE de O. moubata puede utilizarse con bastante fiabilidad como antígeno diagnóstico, la utilización de este extracto de proteínas para la detección de O. moubata presenta varios inconvenientes entre los que se destacan:
• la obtención de SGE, proceso laborioso y poco eficiente en cuanto al rendimiento de la proteína, lo que dificulta su uso para estudios epidemiológicos a gran escala;
• es un extracto de composición compleja y poco conocida, lo cual impide su estandarización y universalización;
• proporciona una elevada reactividad basal, la cual dificulta la detección de sueros positivos con baja reactividad y,
• puede contener componentes antigénicos no específicos que den lugar a falsos positivos.
Por ello, es necesario desarrollar nuevos procedimientos de detección de O. moubata que den lugar a un método de diagnóstico mucho más específico y efectivo que los métodos de diagnóstico conocidos hasta el momento que utilizaban SGE como proteína de detección.
La detección de O. moubata es crucial para facilitar la prevención y control de las enfermedades que transmite, pero la erradicación de esta garrapata del medio doméstico y peridoméstico donde se encuentra, requiere desarrollar métodos alternativos a la detección directa de la garrapata en el medio y, aunque los métodos serológicos permitirían identificar este ectoparásito, aún no se ha encontrado un proteína de detección que de lugar a un método efectivo, sensible y específico de la garrapata.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona unas secuencias aminoacídicas útiles para la detección de anticuerpos específicos frente a O. moubata en muestras biológicas, un método de detección de dichos anticuerpos en muestras biológicas utilizando como proteína de detección las secuencias aminoacídicas de la presente invención, un kit para llevar a cabo dicho método y, finalmente, un kit para la producción de las secuencias aminoacídicas de forma recombinante.
En la presente invención se describen unas secuencias aminoacídicas capaces de identificar de manera especifica y efectiva O. moubata en medios domésticos y peridomésticos.
Es de destacar que las secuencias aminoacídicas propuestas en la presente invención, pertenecen a proteínas salivales del argásido O. moubata que, al contrario con lo que ocurría con SGE, poseen secuencias aminoacídicas, preferiblemente SEQ ID NO: 1, que los inventores han descubierto sorprendentemente, con sensibilidad y especificidad probadas, que dan lugar a la obtención de proteínas para la detección de anticuerpos específicos frente a
O. moubata de manera sencilla y eficiente y, además, al no contener componentes antigénicos no específicos, no existen problemas de falsos positivos.
Por tanto, la presente invención resuelve el problema técnico que plantea la detección de O. moubata para poder combatir las enfermedades que transmite mediante un método serológico simple que emplea una proteína que sirve como antígeno de detección y que permite identificar de manera específica, sensible y eficaz la existencia de anticuerpos específicos frente a la garrapata
O. moubata en muestras de suero provenientes de mamíferos encontrados en medios domésticos y peridomésticos donde pueden habitar dichos hospedadores.
El uso de estas secuencias aminoacídicas permite entre otras aplicaciones:
• la obtención de las proteínas de forma sencilla y eficiente de manera que
puedan ser estandarizadas para su uso en estudios epidemiológicos a 1O gran escala,
• la detección de muestras biológicas infestadas con una elevada sensibilidad y,
• una elevada especificidad frente a anticuerpos de O. moubata debido a que las proteínas, que ha sido obtenidas de una lipocalina de la saliva
de esta... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Secuencia nucleotídica que codifica para una lipocalina TSGP de Orníthodoros moubata que tiene al menos un 66% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1.
2. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 1, donde la lipocalina tiene al menos un 85% de identidad con respecto a la secuencia SEQ 1D NO: 1.
3. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 2, donde la lipocalina es SEQ ID NO: 1.
4. Secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha secuencia nucleotídica es SEQ ID NO: 2.
5. Vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Producto de expresión de la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Producto de expresión según la reivindicación 6 donde dicho producto es una lipocalina TSGP de Orníthodoros moubata que tiene al menos un 66 % de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1.
8. Producto de expresión según la reivindicación 7 donde lipocalina tiene al menos un 85% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1.
9. Producto de expresión según la reivindicación 8 donde la lipocalina tiene la secuencia SEQ ID NO: 1.
1O. Anticuerpo aislado capaz de reconocer el producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
11. Célula transformada que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el vector de expresión según la reivindicación 5 o el producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
12. Composición farmacéutica que comprende el vector de expresión según la reivindicación 5, el producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 o la célula transformada según la reivindicación 11.
13. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según la reivindicación 1 O.
14. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13 que además comprende al menos un excipiente y/o al menos un vehículo farmacológicamente aceptable.
15. Uso de la secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, del vector de expresión según la reivindicación 5, del producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 y/o del anticuerpo según la reivindicación 1 O para la detección y/o cuantificación de O. moubata en una muestra biológica aislada.
16. Uso según la reivindicación 15 donde la muestra biológica es suero ó plasma sanguíneo.
17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 donde la muestra biológica pertenece a un mamífero.
18.
19. Uso de la secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, del vector de expresión según la reivindicación 5, del producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, del anticuerpo según la reivindicación 1 O o de la célula según la reivindicación 11 para la fabricación de un medicamento.
20. Uso según la reivindicación 19 donde el medicamento se utiliza para la prevención y control de una enfermedad transmitida por O. moubata.
21. Uso según la reivindicación 20 donde la enfermedad se selecciona de entre la Fiebre recurrente humana endémica de África oriental, la Peste porcina africana o encefalitis virales.
22. Método para la detección y/o cuantificación de O. moubata, que comprende:
a. detectar y/o cuantificar los anticuerpos descritos en la reivindicación 1 O, en una muestra biológica aislada de un sujeto.
23. Método para la detección y/o cuantificación de O. moubata según la reivindicación 22, que además comprende:
b. comparar los datos obtenidos en el paso (a) con unos valores de referencia para encontrar una desviación significativa, y
c. atribuir la desviación significativa a la presencia de O. moubata en dicho sujeto.
24.
25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, donde la muestra biológica aislada pertenece a un mamífero.
26. Método según la reivindicación 25 donde el mamífero es un humano.
27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, donde la detección y/o cuantificación de los anticuerpos se lleva a cabo mediante inmunoensayo.
28. Método según la reivindicación 27, donde en el inmunoensayo se emplea la secuencia aminoacídica que comprende el producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
29. Kit que comprende el producto de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
30. Kit según la reivindicación 29 que además comprende un soporte sólido donde está fijado dicho producto de expresión.
31. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 29 ó 30 para la detección y/o cuantificación de O. moubata en una muestra biológica aislada.
32. Uso del kit según la reivindicación 31 donde la muestra biológica aislada es suero ó plasma sanguíneo.
33. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32, donde la muestra biológica aislada pertenece a un mamífero.
34. Uso del kit según la reivindicación 33 donde el mamífero es un humano.
35.
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