Anticuerpos monoclonales específicos para diferentes epítopes de GP39 humana y procedimientos para su uso en diagnóstico y terapia.

Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo,

que es específico para gp39 humana, en el que el anticuerpo es el secretado por el hibridoma 39-1.7 designado ATCC HB 11812, 39-1.128 designado ATCC HB 11818 ó 39-1.26 designado ATCC HB 11820.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06012391.

Solicitante: BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 345 Park Avenue New York, NY 10154 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: GILLILAND, LISA K., BAJORATH, JURGEN, ARUFFO, ALEJANDRO, A., HOLLENBAUGH, DIANE, HARRIS, LINDA J., SIADAK, ANTHONY W, GORDON,MARCIA L.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K39/395 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
  • A61K47/48
  • A61K51/10 A61K […] › A61K 51/00 Preparaciones que contienen sustancias radioactivas utilizadas para la terapia o para el examen in vivo. › Anticuerpos o inmunoglobulinas; Sus fragmentos.
  • C07K16/28 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie.
  • C07K19/00 C07K […] › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
  • C12N15/13 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Inmunoglobulinas.
  • C12N5/20 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › siendo uno de los integrantes de la fusión un linfocito B.
  • G01N33/577 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que interviene anticuerpos monoclonados.

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Fragmento de la descripción:

Anticuerpos monoclonales específicos para diferentes epítopes de gp39 humana y procedimientos para su uso en diagnóstico y terapia

Antecedentes de la invención

Una respuesta inmunitaria satisfactoria requiere la interacción coordinada de múltiples tipos de células. La interacción entre linfocitos T colaboradores (Th) y células presentadoras de antígeno (APC) tal como linfocitos B, monocitos y células dendríticas resulta de complejas comunicaciones que implican señales recibidas por citocinas solubles o proteínas unidas a membrana, además de interacciones adhesivas. Muchas de estas señales no son específicas para una respuesta inmunitaria dirigida y las proteínas están ampliamente distribuidas.

Se han identificado varias proteínas de la superficie de linfocitos T importantes que participan en las interacciones célula-célula, que incluyen CD2, CD4, CD8, CD28, LFA-1 CTLA-4 y gp39. Estas proteínas participan en el contacto célula-célula uniéndose a sus contra-receptores sobre APC y proporcionan señales coestimulantes importantes a linfocitos T que modulan señales recibidas por el receptor de antígeno de linfocitos T. Estas señales coestimulantes son necesarias para el linfocito T para que se comprometa completamente y exprese tanto factores unidos a membrana como factores solubles requeridos para la apropiada activación de las células efectoras dependientes de linfocitos T (linfocitos B, linfocitos citolíticos espontáneos, monocitos, neutrófilos, etc.) . El par ligando de linfocitos T/receptor de linfocitos B gp39/CD40 desempeña una función crítica en la respuesta inmunitaria humoral. Estudios in vitro han mostrado que este par de receptor/ligando participa en la proliferación de linfocitos B, producción de anticuerpos y citocinas y viabilidad celular. Estudios in vivo, tanto por bloqueo con un anticuerpo monoclonal como por observación de un defecto genético en gp39, han validado los resultados in vitro, y los han extendido al requisito de una gp39 funcional para la formación de centros germinales durante la respuesta inmunitaria a antígeno.

CD40 es una glucoproteína de membrana de tipo I de 50 kDa expresada por linfocitos B, macrófagos, células dendríticas foliculares, epitelio tímico, epitelio basal normal, algunas líneas celulares derivadas de carcinoma y de melanoma (Clark y Ledbetter 1986, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 83:4494; Paerlie y col., 1985, Cancer Immunol. Immunother. 20:23, Ledbetter y col., 1987, J. Immunol. 138:788; Young y col., 1989, Int. J. Cancer 43:786; Galy y Spits 1992, J. Immunol. 149:775, Alderson y col., 1993, J. Exp. Med. 178:669) y recientemente se ha informado que se expresa en linfocitos T (Armitage y col., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 2326) . Se ha mostrado que es una molécula de señalización importante con un intervalo de efectos en la dirección 3' en múltiples sistemas. Estudios previos mostraron que CD40 participó en la activación de linfocitos B. La reticulación de CD40 con anticuerpo monoclonal anti-CD40 induce la agregación de linfocitos B por LFA-1 (Gordon y col., 1988, J. lmmunol. 140:1425, Barrett y col., 1991, J. Immunol. 146:1722) , aumenta la fosforilación de Ser/Thr (Gordon y col., 1988, arriba) y Tyr (Uckun y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:17478) de varios sustratos intracelulares y proporciona una señal de “competencia” que permite que los linfocitos B proliferen y experimenten cambio de clase cuando se estimulan con la segunda señal apropiada. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-CD40 puede sinergizar con PMA (Gordon y col., 1987, Eur. J. Immunol. 17:1535) o el anticuerpo monoclonal anti-CD20 (Clark y Ledbetter 1986, arriba) para inducir la proliferación de linfocitos B, con IL-4 para inducir la proliferación de linfocitos B (Gordon y col., 1987, arriba; Rousset y col., 1991,

J. Exp. Med. 172:705) y secreción de IgE (Jabara y col., 1990, J. Exp. Med. 172:1861; Gascan y col., 1991, J. lmmunol. 147:8; Rousset y col., 1991, arriba: Zhang y col., 1991, J. Immunol. 146:1836, Shapira y col., 1992, J. Exp. Med. 175:289) y con IL-10 y TGF-º para inducir la secreción de IgA por linfocitos B slgD+ (DeFrance y col., 1992. J. Exp. Med. 175:671) .

El aislamiento del clon de ADNc que codifica CD40 humana (Stamenkovic y col., 1989. EMBO J. 8:1403) muestra que CD40 tiene una homología significativa con la familia de receptores del factor de crecimiento nervioso. Usando una forma soluble de CD40 se encontró que la proteína de fusión CD40-inmunoglobulina (CD40-Ig) (Armitage y col., 1992. Nature 357:80; Lane y col., 1992. Eur. J. Immunol. 22:2573; Noelle y col., 1992, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:6550) , el ligando de CD40 (gp39, CD40-L) , una proteína de aproximadamente 39 kDa, se expresó por linfocitos T humanos y murinos activados. Además, estudios de bloqueo con CD40-Ig (Fanslow y col., 1992, J. Immunol. 149:655; Noelle y col., 1992, arriba) o un anticuerpo monoclonal anti-gp39 murina (MR1) Noelle y col., 1992, arriba) mostraron que la prevención de la unión gp39-CD40 produjo la inhibición de las respuestas biológicas de linfocitos

B.

El ADN complementario que codifica gp39 tanto murina (Armitage y col., 1992, Nature 357:80) como humana (Hollenbaugh y col., 1992, EMBO J. 11:4313; Spriggs y col., 1992, J. Exp. Med. 176:1543) o una forma recombinante soluble de gp39 y IL-4 o gp39 e IL-10 puede accionar linfocitos B humanos para secretar IgE y IgA, o IgG e IgM, respectivamente (Aruffo y col., 1993. Cell 72:291) . Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que gp39 puede ser un “cambio” de linfocitos T responsable de algunos aspectos de la diferenciación de linfocitos B y el cambio de isotipo (Noelle y col., 1992, Immunol. Today 13:431) .

Recientemente, el gen que codifica gp39 se mapeó a Xq26, la región del cromosoma X en la que previamente se había mapeado el gen responsable de síndrome de hiper-lgM (HIM) (Aruffo y col., 1993, Cell 72:291) . Se encontró que las moléculas de gp39 en pacientes con HIM eran funcionalmente anormales. Se ha encontrado que los linfocitos T activados producen niveles normales de ARNm, pero gp39 codificada es defectuosa (Aruffo y col., 1993, arriba; DiSanto y col., 1993, Nature 361:541) .

El síndrome de hiper-IgM es una de las al menos siete inmunodeficiencias heredadas mapeadas al cromosoma X (Kinnon y Levinsky 1992, J. Inherit. Metab Dis. 15:674) . La enfermedad se caracteriza por niveles bajos o ausentes de IgG, IgA e IgE, niveles normales o elevados de IgM, números normales de linfocitos B recirculantes, susceptibilidad a infecciones bacterianas y oportunistas (incluyendo Pneumocystic carinii) , sin centros germinales, autoinmunidad, neutropenia, formas ligadas a X y autosómicas y defectos del gen ligando gp39 en la forma ligada a X de la enfermedad. La inmunodeficiencia variable común (IVC) es otro grupo de trastornos de la inmunodeficiencia caracterizada por respuestas anormales de anticuerpos e infecciones bacterianas recurrentes. Las presentaciones clínicas de la IVC son diversas, ya que los trastornos descritos por el término incluyen una amplia variedad de defectos todavía sin caracterizar. Estados de enfermedad descritos como IVC comúnmente muestran IgG e IgA en suero reducida o ausente, mientras que los niveles de IgM pueden ser normales o reducidos. Aunque la mayoría de los pacientes con IVC tienen números y respuestas de linfocitos T normales, algunos pueden tener números reducidos, relaciones de células CD4/CD8 anormales o función de linfocitos T anormal. También hay una elevada probabilidad de anticuerpos autoinmunitarios en esta población de pacientes.

Las mutaciones en el gen que codifica gp39 producen deleciones que dan lugar a desplazamientos del marco y a codones de terminación prematuros, o mutaciones puntuales que producen sustituciones de aminoácidos (Allen y col., 1993, Science 259:990. DiSanto y col., 1993, arriba; Fuleichan y col., 1993, arriba, Korthauer y col., 1993, arriba; Aruffo y col., 1993, arriba; Collard y col., 1993. Immunol. Today 14:559) . El efecto de estas mutaciones sobre la expresión de gp39 por linfocitos T activados se ha examinado usando CD40-Ig soluble, anticuerpo policlonal producido contra una proteína de fusión bacteriana gp39 (anti-TRAP) (Graf y col., 1992. Eur. J. Immunol 22:3191; Korthauer y col., 1993, Nature 361:539) y un anticuerpo monoclonal específico para gp39 5c8 (Lederman y col., 1992, J. Exp. Med. 175:1091) . Tiñendo con CD40-Ig soluble se encontró que la expresión de gp39 estaba ausente, mientras que para anti-TRAP era normal en linfocitos T de uno de los tres pacientes probados, que se confirmó usando el anticuerpo monoclonal.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo, que es específico para gp39 humana, en el que el anticuerpo es el secretado por el hibridom.

3. 1.7 designado ATCC HB 11812.

3. 1.128 designado ATCC HB 11818 .

3. 1.26 designado ATCC HB 11820.

2. El fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en el que el fragmento se deriva del anticuerpo secretado por el hibridom.

3. 1.7 designado ATCC HB 11812.

3. 1.128 designado ATCC HB 11818 .

3. 1.26 designado ATCC HB 11820.

3. El fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en el que el fragmento es Fab, F (ab1) 2 o Fv.

4. La proteína de unión recombinante de la reivindicación 1, en la que la proteína es sFv, un anticuerpo humanizado

o una proteína recombinante que comprende una región variable de un anticuerpo de la reivindicación 1.

5. Un procedimiento in vitro para la detección de síndrome hiper-IgM ligado a X que comprende:

(a) linfocitos de sangre periférica aislados proporcionados de un paciente;

(b) activar los linfocitos de sangre periférica aislados;

(c) fijar y permeabilizar los linfocitos de sangre periférica aislados y activados,

(d) mezclar un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 con los linfocitos de sangre periférica activados, fijados y permeabilizados;

(e) detectar el anticuerpo unido a las células.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo está conjugado con una marca detectable.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el procedimiento comprende además la etapa de añadir un anticuerpo secundario marcado específico para el primer anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo, después de la etapa (d) .

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la marca es un fluoróforo, isótopo radiactivo, enzima o cromóforo.

9. Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con marcador detectable.

10. Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el marcador detectable es un fluoróforo, isótopo radiactivo, enzima

o cromóforo.

11. Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo está conjugado con un agente terapéutico.

12. Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante de la reivindicación 11, en el que el agente terapéutico es un radioisótopo, una toxina o un agente quimioterapéutico.

13. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína de unión recombinante comprende una región variable que puede unirse al antígeno y una toxina de proteína o agente terapéutico en forma de una proteína de fusión.

14. Hibridoma HB 11812, HB 11818, HB 11820 como el depositado en la Colección americana de cultivos tipo.

15. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada y purificada que codifica una cadena ligera de la inmunoglobulina variable que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de SEC ID Nº 16.

16. La secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 15, en la que la secuencia de ácidos nucleicos es la de SEC ID Nº 15.

17. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada y purificada que codifica una cadena pesada de la región variable de la inmunoglobulina que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de SEC ID Nº 18.

18. La secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 17, en la que la secuencia de ácidos nucleicos es la de SEC ID Nº 17.

19. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con un marcador detectable y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o

fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con un agente terapéutico y un agente farmacéuticamente aceptable.

22. Un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con un marcador detectable para su uso en la obtención de imágenes de células que expresan gp39 sobre su superficie en un paciente que comprende:

(a) administrar a un paciente una composición farmacéutica de la reivindicación 20 en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión proteína/antígeno sobre la superficie de las células que expresan gp39; y

(b) detectar la presencia del complejo de unión proteína/antígeno sobre la superficie de las células como se indica por la presencia del marcador detectable.


 

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