Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo,

que es específico para gp39 humana, en el que el anticuerpo es el secretado por el hibridoma 39-1.7 designado ATCC HB 11812, 39-1.128 designado ATCC HB 11818 ó 39-1.26 designado ATCC HB 11820.

Anticuerpos monoclonales específicos para diferentes epítopes de gp39 humana y procedimientos para su uso en diagnóstico y terapia

Antecedentes de la invención

Una respuesta inmunitaria satisfactoria requiere la interacción coordinada de múltiples tipos de células. La interacción entre linfocitos T colaboradores (Th) y células presentadoras de antígeno (APC) tal como linfocitos B, monocitos y células dendríticas resulta de complejas comunicaciones que implican señales recibidas por citocinas solubles o proteínas unidas a membrana, además de interacciones adhesivas. Muchas de estas señales no son específicas para una respuesta inmunitaria dirigida y las proteínas están ampliamente distribuidas.

Se han identificado varias proteínas de la superficie de linfocitos T importantes que participan en las interacciones célula-célula, que incluyen CD2, CD4, CD8, CD28, LFA-1 CTLA-4 y gp39. Estas proteínas participan en el contacto célula-célula uniéndose a sus contra-receptores sobre APC y proporcionan señales coestimulantes importantes a linfocitos T que modulan señales recibidas por el receptor de antígeno de linfocitos T. Estas señales coestimulantes son necesarias para el linfocito T para que se comprometa completamente y exprese tanto factores unidos a membrana como factores solubles requeridos para la apropiada activación de las células efectoras dependientes de linfocitos T (linfocitos B, linfocitos citolíticos espontáneos, monocitos, neutrófilos, etc.) . El par ligando de linfocitos T/receptor de linfocitos B gp39/CD40 desempeña una función crítica en la respuesta inmunitaria humoral. Estudios in vitro han mostrado que este par de receptor/ligando participa en la proliferación de linfocitos B, producción de anticuerpos y citocinas y viabilidad celular. Estudios in vivo, tanto por bloqueo con un anticuerpo monoclonal como por observación de un defecto genético en gp39, han validado los resultados in vitro, y los han extendido al requisito de una gp39 funcional para la formación de centros germinales durante la respuesta inmunitaria a antígeno.

CD40 es una glucoproteína de membrana de tipo I de 50 kDa expresada por linfocitos B, macrófagos, células dendríticas foliculares, epitelio tímico, epitelio basal normal, algunas líneas celulares derivadas de carcinoma y de melanoma (Clark y Ledbetter 1986, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 83:4494; Paerlie y col., 1985, Cancer Immunol. Immunother. 20:23, Ledbetter y col., 1987, J. Immunol. 138:788; Young y col., 1989, Int. J. Cancer 43:786; Galy y Spits 1992, J. Immunol. 149:775, Alderson y col., 1993, J. Exp. Med. 178:669) y recientemente se ha informado que se expresa en linfocitos T (Armitage y col., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 2326) . Se ha mostrado que es una molécula de señalización importante con un intervalo de efectos en la dirección 3' en múltiples sistemas. Estudios previos mostraron que CD40 participó en la activación de linfocitos B. La reticulación de CD40 con anticuerpo monoclonal anti-CD40 induce la agregación de linfocitos B por LFA-1 (Gordon y col., 1988, J. lmmunol. 140:1425, Barrett y col., 1991, J. Immunol. 146:1722) , aumenta la fosforilación de Ser/Thr (Gordon y col., 1988, arriba) y Tyr (Uckun y col., 1991, J. Biol. Chem. 266:17478) de varios sustratos intracelulares y proporciona una señal de “competencia” que permite que los linfocitos B proliferen y experimenten cambio de clase cuando se estimulan con la segunda señal apropiada. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-CD40 puede sinergizar con PMA (Gordon y col., 1987, Eur. J. Immunol. 17:1535) o el anticuerpo monoclonal anti-CD20 (Clark y Ledbetter 1986, arriba) para inducir la proliferación de linfocitos B, con IL-4 para inducir la proliferación de linfocitos B (Gordon y col., 1987, arriba; Rousset y col., 1991,

J. Exp. Med. 172:705) y secreción de IgE (Jabara y col., 1990, J. Exp. Med. 172:1861; Gascan y col., 1991, J. lmmunol. 147:8; Rousset y col., 1991, arriba: Zhang y col., 1991, J. Immunol. 146:1836, Shapira y col., 1992, J. Exp. Med. 175:289) y con IL-10 y TGF-º para inducir la secreción de IgA por linfocitos B slgD+ (DeFrance y col., 1992. J. Exp. Med. 175:671) .

El aislamiento del clon de ADNc que codifica CD40 humana (Stamenkovic y col., 1989. EMBO J. 8:1403) muestra que CD40 tiene una homología significativa con la familia de receptores del factor de crecimiento nervioso. Usando una forma soluble de CD40 se encontró que la proteína de fusión CD40-inmunoglobulina (CD40-Ig) (Armitage y col., 1992. Nature 357:80; Lane y col., 1992. Eur. J. Immunol. 22:2573; Noelle y col., 1992, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:6550) , el ligando de CD40 (gp39, CD40-L) , una proteína de aproximadamente 39 kDa, se expresó por linfocitos T humanos y murinos activados. Además, estudios de bloqueo con CD40-Ig (Fanslow y col., 1992, J. Immunol. 149:655; Noelle y col., 1992, arriba) o un anticuerpo monoclonal anti-gp39 murina (MR1) Noelle y col., 1992, arriba) mostraron que la prevención de la unión gp39-CD40 produjo la inhibición de las respuestas biológicas de linfocitos

B.

El ADN complementario que codifica gp39 tanto murina (Armitage y col., 1992, Nature 357:80) como humana (Hollenbaugh y col., 1992, EMBO J. 11:4313; Spriggs y col., 1992, J. Exp. Med. 176:1543) o una forma recombinante soluble de gp39 y IL-4 o gp39 e IL-10 puede accionar linfocitos B humanos para secretar IgE y IgA, o IgG e IgM, respectivamente (Aruffo y col., 1993. Cell 72:291) . Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que gp39 puede ser un “cambio” de linfocitos T responsable de algunos aspectos de la diferenciación de linfocitos B y el cambio de isotipo (Noelle y col., 1992, Immunol. Today 13:431) .

Recientemente, el gen que codifica gp39 se mapeó a Xq26, la región del cromosoma X en la que previamente se había mapeado el gen responsable de síndrome de hiper-lgM (HIM) (Aruffo y col., 1993, Cell 72:291) . Se encontró que las moléculas de gp39 en pacientes con HIM eran funcionalmente anormales. Se ha encontrado que los linfocitos T activados producen niveles normales de ARNm, pero gp39 codificada es defectuosa (Aruffo y col., 1993, arriba; DiSanto y col., 1993, Nature 361:541) .

El síndrome de hiper-IgM es una de las al menos siete inmunodeficiencias heredadas mapeadas al cromosoma X (Kinnon y Levinsky 1992, J. Inherit. Metab Dis. 15:674) . La enfermedad se caracteriza por niveles bajos o ausentes de IgG, IgA e IgE, niveles normales o elevados de IgM, números normales de linfocitos B recirculantes, susceptibilidad a infecciones bacterianas y oportunistas (incluyendo Pneumocystic carinii) , sin centros germinales, autoinmunidad, neutropenia, formas ligadas a X y autosómicas y defectos del gen ligando gp39 en la forma ligada a X de la enfermedad. La inmunodeficiencia variable común (IVC) es otro grupo de trastornos de la inmunodeficiencia caracterizada por respuestas anormales de anticuerpos e infecciones bacterianas recurrentes. Las presentaciones clínicas de la IVC son diversas, ya que los trastornos descritos por el término incluyen una amplia variedad de defectos todavía sin caracterizar. Estados de enfermedad descritos como IVC comúnmente muestran IgG e IgA en suero reducida o ausente, mientras que los niveles de IgM pueden ser normales o reducidos. Aunque la mayoría de los pacientes con IVC tienen números y respuestas de linfocitos T normales, algunos pueden tener números reducidos, relaciones de células CD4/CD8 anormales o función de linfocitos T anormal. También hay una elevada probabilidad de anticuerpos autoinmunitarios en esta población de pacientes.

Las mutaciones en el gen que codifica gp39 producen deleciones que dan lugar a desplazamientos del marco y a codones de terminación prematuros, o mutaciones puntuales que producen sustituciones de aminoácidos (Allen y col., 1993, Science 259:990. DiSanto y col., 1993, arriba; Fuleichan y col., 1993, arriba, Korthauer y col., 1993, arriba; Aruffo y col., 1993, arriba; Collard y col., 1993. Immunol. Today 14:559) . El efecto de estas mutaciones sobre la expresión de gp39 por linfocitos T activados se ha examinado usando CD40-Ig soluble, anticuerpo policlonal producido contra una proteína de fusión bacteriana gp39 (anti-TRAP) (Graf y col., 1992. Eur. J. Immunol 22:3191; Korthauer y col., 1993, Nature 361:539) y un anticuerpo monoclonal específico para gp39 5c8 (Lederman y col., 1992, J. Exp. Med. 175:1091) . Tiñendo con CD40-Ig soluble se encontró que la expresión de gp39 estaba ausente, mientras que para anti-TRAP era normal en linfocitos T de uno de los tres pacientes probados, que se confirmó usando el anticuerpo monoclonal.... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo, que es específico para gp39 humana, en el que el anticuerpo es el secretado por el hibridom.

3. 1.7 designado ATCC HB 11812.

3. 1.128 designado ATCC HB 11818 .

3. 1.26 designado ATCC HB 11820.

2. El fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en el que el fragmento se deriva del anticuerpo secretado por el hibridom.

3. 1.7 designado ATCC HB 11812.

3. 1.128 designado ATCC HB 11818 .

3. 1.26 designado ATCC HB 11820.

3. El fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en el que el fragmento es Fab, F (ab1) 2 o Fv.

4. La proteína de unión recombinante de la reivindicación 1, en la que la proteína es sFv, un anticuerpo humanizado

o una proteína recombinante que comprende una región variable de un anticuerpo de la reivindicación 1.

5. Un procedimiento in vitro para la detección de síndrome hiper-IgM ligado a X que comprende:

(a) linfocitos de sangre periférica aislados proporcionados de un paciente;

(b) activar los linfocitos de sangre periférica aislados;

(c) fijar y permeabilizar los linfocitos de sangre periférica aislados y activados,

(d) mezclar un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 con los linfocitos de sangre periférica activados, fijados y permeabilizados;

(e) detectar el anticuerpo unido a las células.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo está conjugado con una marca detectable.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el procedimiento comprende además la etapa de añadir un anticuerpo secundario marcado específico para el primer anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo, después de la etapa (d) .

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que la marca es un fluoróforo, isótopo radiactivo, enzima o cromóforo.

9. Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con marcador detectable.

10. Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el marcador detectable es un fluoróforo, isótopo radiactivo, enzima

o cromóforo.

11. Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo está conjugado con un agente terapéutico.

12. Un anticuerpo monoclonal, un fragmento de unión a antígeno o proteína de unión recombinante de la reivindicación 11, en el que el agente terapéutico es un radioisótopo, una toxina o un agente quimioterapéutico.

13. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la proteína de unión recombinante comprende una región variable que puede unirse al antígeno y una toxina de proteína o agente terapéutico en forma de una proteína de fusión.

14. Hibridoma HB 11812, HB 11818, HB 11820 como el depositado en la Colección americana de cultivos tipo.

15. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada y purificada que codifica una cadena ligera de la inmunoglobulina variable que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de SEC ID Nº 16.

16. La secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 15, en la que la secuencia de ácidos nucleicos es la de SEC ID Nº 15.

17. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada y purificada que codifica una cadena pesada de la región variable de la inmunoglobulina que tiene la secuencia de residuos de aminoácidos de SEC ID Nº 18.

18. La secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 17, en la que la secuencia de ácidos nucleicos es la de SEC ID Nº 17.

19. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con un marcador detectable y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o

fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con un agente terapéutico y un agente farmacéuticamente aceptable.

22. Un anticuerpo monoclonal, fragmento de unión a antígeno o fragmento de unión recombinante del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, conjugado con un marcador detectable para su uso en la obtención de imágenes de células que expresan gp39 sobre su superficie en un paciente que comprende:

(a) administrar a un paciente una composición farmacéutica de la reivindicación 20 en condiciones que permitan la formación de un complejo de unión proteína/antígeno sobre la superficie de las células que expresan gp39; y

(b) detectar la presencia del complejo de unión proteína/antígeno sobre la superficie de las células como se indica por la presencia del marcador detectable.