ANTICUERPOS HUMANOS ESPECÍFICOS PARA INTERLEUQUINA 15 (IL-15).

Anticuerpos humanos específicos para interleuquina 15 (IL-15) Antecedentes de la Invención La interleuquina 15 (IL-15) es una citoquina proinflamatoria, una glicoproteína de 14-15 kD. Se ha informado de la expresión constitutiva en diversas células y tejidos incluyendo monocitos y macrófagos, fibroblastos, queratinocitos y células dendríticas (Waldmann y Tagaya, 1999; Fehniger y Caligiuri, 2001). La expresión está regulada al alza en condiciones inflamatorias, como se ha informado para monocitos estimulados con IFN- y LPS o mediante infección con virus, bacterias o protozoos (Kirman et al., 1998; Waldmann et al., 1998; Waldmann y Tagaya, 1999; Fehniger y Caligiuri, 2001). Además, en las enfermedades inflamatorias crónicas tales como la artritis reumatoide, es probable que la IL-15 producida localmente amplifique la inflamación por el reclutamiento y la activación de las células T sinoviales. Se ha sugerido que este efecto inducido por IL-15 juega un papel fundamental en la patogénesis de la enfermedad (Kirman et al., 1998; McInnes et al., 1996; McInnes et al., 1997; McInnes y Liew, 1998; Fehniger y Caligiuri, 2001). Los estudios in vitro han demostrado que IL-15 comparte varias actividades biológicas con IL-2, debido a los componentes receptores compartidos. El receptor de IL-15 presente en las células T consiste en una única cadena , IL-15R, pero comparte la cadena ß y la cadena con IL-2R. Como consecuencia, ambos receptores utilizan los mismos elementos de señalización Jak/STAT. Sin embargo, basándose en la regulación compleja y la expresión diferencial de IL-2 e IL-15 y sus receptores, se ha informado sobre diferencias críticas en las funciones in vivo (Kirman et al., 1998; Waldmann y Tagaya, 1999; Waldmann et al., 2001). También es importante observar el papel no redundante para el desarrollo, la supervivencia, la expansión y la función de IL-15 en células asesinas naturales (NK), células T NK y linfocitos intraepiteliales (Kennedy et al., 2000; Liu et al., 2000). McInnes y colaboradores (McInnes et al., 1997; McInnes y Liew, 1998) informaron de la inducción de la producción de TNF- después de la estimulación por IL-15 en células T derivadas de pacientes con artritis reumatoide. Además, se demostró que las células T de sangre periférica activadas por IL-15 inducen una producción de TNF- significativa por los macrófagos a través de un mecanismo dependiente del contacto celular. Debido al papel destructivo del TNF- en la artritis reumatoide, la inhibición de esta citoquina disminuye la actividad de la enfermedad (Bathon et al., 2000; Klippel, 2000; Lovell et al., 2000; Maini y Taylor, 2000). En el documento US 5.795.966 se describen antagonistas de IL-15 de mamífero incluyendo muteínas de IL-15, anticuerpos monoclonales contra IL-15 y productos conjugados con IL-15 que reducen la capacidad de IL-15 para estimular la proliferación de linfocitos T en un análisis CTLL in vitro. Compendio de la Invención La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado que: (a) se une a IL-15 humana; (b) inhibe los efectos pro-inflamatorios inducidos por IL-15; y (c) comprende una región variable de una cadena pesada humana que comprende las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 y una región variable de la cadena ligera humana que comprende las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3, donde: (i) la secuencia CDR3 de la región variable de la cadena pesada humana comprende los residuos de aminoácido 100-107 del SEQ ID NO: 2; la secuencia CDR3 de la región variable de la cadena ligera humana comprende los residuos de aminoácido 90-97 del SEQ ID NO: 4; (ii) la secuencia CDR2 de la región variable de la cadena pesada humana comprende los residuos de aminoácido 50-66 del SEQ ID NO: 2 y la secuencia CDR2 de la región variable de la cadena ligera humana comprende los residuos de aminoácido 51-57 del SEQ ID NO: 4; y (iii) la secuencia CDR1 de la región variable de la cadena pesada humana comprende los residuos de aminoácido 31-35 del SEQ ID NO: 2 y la secuencia CDR1 de la región variable de la cadena ligera humana comprende los residuos de aminoácido 24-35 del SEQ ID NO: 4. La presente invención se basa en la generación y el aislamiento, por primera vez, de anticuerpos monoclonales completamente humanos descritos más arriba que se unen específicamente a IL-15 humana y que inhiben los efectos pro-inflamatorios inducidos por IL-15, así como la caracterización de tales anticuerpos novedosos y la demostración de su valor terapéutico en el tratamiento de una variedad de enfermedades mediadas por IL-15. Por ejemplo, como se describe en la presente memoria, se ha demostrado que los anticuerpos humanos inhiben tanto la producción de TNF como la proliferación de células T, ambas las cuales están implicadas íntegramente en los trastornos inflamatorios. Por consiguiente, los anticuerpos humanos de la presente invención proporcionan un método mejorado para tratar y prevenir tales trastornos (y cualquier otro trastorno mediado por IL-15), atribuibles en parte a su especificidad única (p. ej., especificidad de epítopo y especie), afinidad, estructura, actividad funcional y el 2   hecho de que son completamente humanos, haciéndolos significativamente menos inmunogénicos y más eficaces y útiles terapéuticamente cuando se administran a pacientes humanos que otros anticuerpos para IL-15 generados anteriormente (p. ej., anticuerpos murinos y humanizados). La presente invención también proporciona aplicaciones terapéuticas, incluyendo el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como la artritis reumatoide, la psoriasis, el rechazo de transplantes y los cánceres, para los anticuerpos que inhiben IL-15 de la invención. Los anticuerpos humanos aislados de la invención incluyen una variedad de isotipos de anticuerpos, tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, e IgE. Típicamente, incluyen los isotipos IgG1 (p. ej., IgG1k), IgG3 e IgM. Los anticuerpos pueden ser completos (p. ej., un anticuerpo IgG1 o IgG3) o pueden incluir solamente una porción de unión al antígeno (p. ej., un fragmento Fab, F(ab')2, Fv, o Fv de cadena sencilla). En una realización, los anticuerpos humanos son anticuerpos recombinantes. En una realización concreta, el anticuerpo humano está codificado por ácidos nucleicos de una cadena pesada IgG humana y una cadena ligera kappa humana que comprenden secuencias de nucleótidos en sus regiones variables como se expone en el SEQ ID NO: 1 y el SEQ ID NO: 3, respectivamente, y las modificaciones de las secuencias conservativas de las mismas. En otra realización, el anticuerpo humano incluye regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera kappa que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en el SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente, y las modificaciones de la secuencia conservativa de las mismas. Los anticuerpos humanos de la invención se pueden producir recombinantemente en una célula anfitriona, tal como un transfectoma (p. ej., un transfectoma que consiste en células CHO inmortalizadas o células linfocíticas) que contienen ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, o ser obtenidos directamente de un hibridoma que expresa el anticuerpo (p. ej., que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, p. ej., un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de una cadena pesada humana y un transgén de una cadena ligera humana que codifican el anticuerpo, fusionados a una célula inmortalizada). En una realización concreta, los anticuerpos son producidos por un hibridoma referido en la presente memoria como 146B7 o por un transfectoma de una célula anfitriona (p. ej., una célula CHO) que contiene los ácidos nucleicos de la cadena pesada humana y la cadena ligera humana que comprenden secuencias de nucleótidos en sus regiones variables como se expone en los SEQ ID NO: 1 y 3, respectivamente, y las modificaciones conservativas de las mismas. También se describen en la presente memoria anticuerpos que son producidos por hibridomas referidos en la presente memoria como 146B7, 146H5, 404E4, y 404A8. En una realización preferida, el anticuerpo se une específicamente a un epítopo localizado en el dominio que interacciona con la cadena ß y/o de IL-15. Los anticuerpos humanos de la presente invención se unen específicamente a IL-15 humana e inhiben la capacidad de IL-15 para inducir efectos pro-inflamatorios, p. ej., inhiben la producción de TNF y/o inhiben la proliferación de células T, tales como PBMC o células T CTLL-2, después de la unión de IL-15 al receptor de IL-15. Típicamente, los anticuerpos humanos se unen a IL-15 con una constante de disociación en el equilibrio (KD) de menos de aproximadamente 10 -7 M, tal como menos de aproximadamente 10 -8 M, 10 -9 M o 10 10 M o incluso menos cuando se determina... [Seguir leyendo]

(a) se une a IL-15 humana; (b) inhibe los efectos proinflamatorios inducidos por IL-15; y (c) comprende una región variable de la cadena pesada humana que comprende las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3 y una región variable de la cadena ligera humana que comprende las secuencias CDR1, CDR2, y CDR3, donde: (i) la secuencia CDR3 de la región variable de la cadena pesada humana comprende los residuos de aminoácido 100-107 del SEQ ID NO:2; y la secuencia CDR3 de la región variable de la cadena ligera humana comprende los residuos de aminoácido 90-97 del SEQ ID NO: 4; (ii) la secuencia CDR2 de la región variable de la cadena pesada humana comprende los residuos de aminoácido 50-66 del SEQ ID NO: 2 y la secuencia CDR2 de la región variable de la cadena ligera humana comprende los residuos de aminoácido 51-57 del SEQ ID NO: 4; y (iii) la secuencia CDR1 de la región variable de la cadena pesada humana comprende los residuos de aminoácido 31-35 del SEQ ID NO: 2 y la secuencia CDR1 de la región variable de la cadena ligera humana comprende los residuos de aminoácido 24-35 del SEQ ID NO: 4. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que (a) inhibe la producción de TNF; (b) inhibe la proliferación de células T; (c) inhibe la proliferación de queratinocitos; y (d) inhibe la quimiotaxis de los leucocitos activados. 3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, que no se une a los mutantes Q108S y D8SQ108S de IL-15. 4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende una región variable de la cadena pesada humana y una región variable de la cadena ligera humana, donde las regiones variables de la cadena pesada humana y de la cadena ligera humana comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en el SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente, y modificaciones de secuencia conservativas de las mismas. 5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se selecciona entre un anticuerpo IgG1, un IgG2, un IgG3, un IgG4, un IgM, un IgA1, un IgA2, un IgAsec, un IgD y un IgE. 6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende una cadena pesada de IgG1 y un cadena kappa ligera. 7. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es un anticuerpo completo, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena sencilla. 8. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores producido por medio de un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera humana fusionados a una célula inmortalizada o por medio de un transfectoma que comprende ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada humana y una cadena ligera humana. 9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende una porción de unión al antígeno del anticuerpo. 10. Un método in vitro para inhibir la producción de TNF inducida por IL-15, pero no inducida por IL-2, en células T o monocitos, que comprende poner en contacto IL-15 con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 11. Un método in vitro para inhibir la producción de células T inducida por IL-15, pero no inducida por IL-2, que comprende poner en contacto IL-15 con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 12. El método de la reivindicación 11, donde las células T son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o células CTLL-2. 13. Un hibridoma que comprende una célula B obtenida de un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera, fusionados a una célula inmortalizada, donde el hibridoma produce el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 44   14. Un transfectoma que comprende ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada humana y una cadena ligera humana, donde el transfectoma produce una cantidad detectable del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 15. El transfectoma de la reivindicación 14, donde los ácidos nucleicos comprenden las secuencias de nucleótidos mostradas en el SEQ ID NO: 1 y el SEQ ID NO: 3, o modificaciones conservativas de las mismas. 16. Un animal no humano transgénico que expresa el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el animal no humano transgénico tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera humana. 17. Un método para producir el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende: fusionar las células B aisladas de un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera humana y que ha sido inmunizado con IL-15 humana o una célula que expresa IL-15 humana, de manera que los anticuerpos son producidos por las células B del animal con células de mieloma para formar células de hibridoma, inmortales que secretan anticuerpos monoclonales humanos específicos para IL-15; y aislar los anticuerpos monoclonales humanos específicos para IL-15 a partir del sobrenadante de cultivo del hibridoma. 18. Un producto inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un agente terapéutico. 19. El producto inmunoconjugado de la reivindicación 18, donde el agente terapéutico es un agente inmunosuopresor, un agente citotóxico o un agente antiinflamatorio seleccionado entre un agente antiinflamatorio esteroideo, un agente antiinflamatorio no esteroideo y un FARME. 20. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un portador farmacéuticamente aceptable. 21. La composición de la reivindicación 20 que comprende adicionalmente un agente terapéutico. 22. La composición de la reivindicación 21, donde el agente es un agente inmunosupresor, un anticuerpo, un agente para tratar la psoriasis, un agente antiinflamatorio seleccionado entre un agente antiinflamatorio esteroideo y un agente antiinflamatorio no esteroideo, un FARME seleccionado entre metotrexato, etanercept y infliximab o un agente quimioterapéutico seleccionado entre doxorrubicina, cisplatino, bleomicina, carmustina, ciclofosfamida y clorambucil. 23. La composición de la reivindicación 22, donde el agente inmunosupresor es la ciclosporina. 24. La composición de la reivindicación 22, donde el anticuerpo es un anticuerpo específico de CD4 o un anticuerpo específico de IL-2. 25. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano por medio de terapia. 26. El uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno seleccionado entre la psoriasis, la artritis, las enfermedades inflamatorias intestinales, el cáncer, el rechazo de trasplantes y las enfermedades infecciosas. 27. El uso de la reivindicación 26, donde la artritis es la artritis reumatoide. 28. El uso de la reivindicación 26 o 27, donde el tratamiento o la prevención comprenden adicionalmente la administración simultánea de otro agente terapéutico. 29. El uso de la reivindicación 28, donde el agente terapéutico se define como en una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24. 30. Un método para diagnosticar una enfermedad mediada por IL-15 por medio de la detección de la presencia del antígeno IL-15, o una célula que expresa IL-15, en una muestra que comprende poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo e IL-15 y detectar la formación de un complejo, donde una diferencia en la formación del complejo entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa de la presencia de IL-15 en la muestra.   31. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 32. El ácido nucleico de la reivindicación 31 que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el SEQ ID NO: 1, el SEQ ID NO: 3 y modificaciones conservativas de la misma. 33. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de una cadena ligera, una cadena pesada, o de ambas cadenas ligera y pesada, del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera comprende el SEQ ID NO:3 y la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada comprende el SEQ ID NO: 1. 34. Un transfectoma que comprende el vector de expresión de la reivindicación 33. 46   47   48   49     51   52   53   54     56   57   58   59     61   62   63   64