Un anticuerpo monoclonal que se une a NOGO humana y la neutraliza,

comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos SEC ID: NO: 86, SEC ID: NO: 88, SEC ID: NO: 89 o SEC ID: NO: 90 y una región de cadena ligera, que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID: NO: 23 o SEC ID: NO: 25, o una variante correspondiente que comprende un análogo de una región de determinación de complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo, en el cual dicha variante mantiene la especificidad de unión y la capacidad de neutralización del anticuerpo del que se deriva,

Anticuerpos humanizados especificos para NOGO-A y sus usos farmaceuticos

Campo de la Invención

La presente invencion se refiere a las inmunoglobulinas, particularmente a los anticuerpos que se unen a NOGO y que neutralizan su actividad, a polinucleotidos que codifican tales anticuerpos, a formulaciones farmaceuticas que contienen los anticuerpos y al uso de tales anticuerpos en el tratamiento y/o profilaxis de las enfermedades neurologicas.

Antecedentes de la Invención

El infarto cerebral es una causa importante de muerte y discapacidad en el mundo occidental. No existe una terapia aprobada para el tratamiento del infarto cerebral distinto del tejido plasminogeno (t-PA) que se tiene que administrar en las primeras 3 horas del inicio despues de una exploracion tomografica por computadora (CT, por sus siglas en ingles) para excluir la existencia de hemorragia. Hasta la fecha la mayoria de los agentes terapeuticos dirigidos hacia el tratamiento del infarto cerebral agudo (es decir neuroproteccion) , han implicado predominantemente la deteccion de los receptores de glutamato y sus trayectorias de senalizacion descendentes conocidas por estar implicadas en la muerte celular aguda. No obstante hasta la fecha estas estrategias han probado no tener exito en los ensayos clinicos y se asocian frecuentemente a efectos secundarios limitados por la dosis (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (suppl III) 10-14 (1998) ) . Por lo tanto hay una necesidad de nuevos procedimientos dirigidos hacia el mejoramiento de la muerte celular despues del detenimiento de flujo sanguineo. La neuroproteccion es la capacidad de un tratamiento para prevenir o mejorar la perdida de celulas neuronales en respuesta a un proceso danino o de enfermedad. Esta se puede lograr detectando las neuronas directa o indirectamente al prevenir la perdida de celulas gliales (incluyendo oligodendrocitos) .

Despues del inicio del infarto cerebral, un cierto grado de recuperacion funcional espontanea se observa en muchos pacientes, sugiriendo que el cerebro tiene la capacidad (aunque limitada) de repararse y/o restaurarse despues de la lesion. Los agentes que tienen el potencial de mejorar esta recuperacion por lo tanto pueden permitir que la intervencion sea hecha mucho mas adelante (potencialmente dias) despues del inicio de la isquemia cerebral. Los agentes que pueden ofrecer la neuroproteccion aguda y mejorar la recuperacion funcional pueden proporcionar ventajas importantes sobre las estrategias de neuroproteccion potenciales actuales.

Actualmente son bien conocidos los mecanismos que causan la recuperacion funcional. El brote de axones danados

o no danados se ha propuesto como un mecanismo posible. Sin embargo, aunque los estudios in vivo han mostrado que el tratamiento de la lesion a la medula espinal o infarto cerebral con factores neurotroficos da lugar a la recuperacion funcional mejorada y a un grado de brote axonal, estos no prueban un enlace directo entre el grado de brote axonal y el grado de recuperacion funcional (Jakeman, y col. 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata y col. 1997, Proc Acad Natl. Sci. E.E.U.U., 94:8179-8184, Ribotta, y col. 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152) . Ademas, el brote axonal requiere una neurona viable. En enfermedades tal como infarto cerebral que se asocia a la muerte celular extensa, el mejoramiento de la recuperacion funcional ofrecido por un agente post-infarto dado puede por lo tanto ser a traves de mecanismos distintos del brote axonal tal como la diferenciacion de las celulas madre endogenas, la activacion de las trayectorias redundantes, los cambios de la distribucion del receptor o la excitabilidad de la neuronas o glias (Fawcett & Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Homer & Galga, 2000, Nature 407 963-970) .

La capacidad limitada del sistema nervioso central (CNS) de repararse despues de la lesion se puede deber a las moleculas dentro del ambiente del CNS que tienen un efecto inhibidor sobre el brote axonal (excrecencia del exson) tal como la proteina NOGO de mielina (Sato S. y col. (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163, 1473-1480; McKerracher L y col. (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G y col. (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer y col. (1996) Neuron 16, 1107-1113; WO9522344; WO9701352; Prinjha R y col. (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS y col. (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T y col. (2000) Nature 403, 439-444; US005250414A; WO200005364A1; WO0031235) .

Se han identificado tres formas de NOGO humana: residuos 1192 de aminoacido que tienen NOGO-A (Acceso GenBank No. AJ251383) ; NOGO-B, una variante de union que carece de los residuos 186 a 1004 en el dominio extracelular putativo (Acceso GenBank No. AJ251384) y una variante mas corta de union, NOGO-C, que tambien carece de los residuos 186 a 1004 y tambien tiene un dominio terminal amino alternativo mas pequeno (Acceso GenBank No. AJ251385) (Prinjha y col. (2000) supra) .

La inhibicion de las proteinas inhibidoras del CNS tal como NOGO puede proporcionar medios terapeuticos para mejorar el dano neuronal y promover la reparacion y crecimiento neuronal, de tal modo ayudan potencialmente a la recuperacion de la lesion neuronal tal como la mantenida en el infarto cerebral. Los ejemplos de tales inhibidores de NOGO pueden incluir moleculas pequenas, peptidos y anticuerpos.

Los anticuerpos comprenden comunmente dos cadenas pesadas ligadas juntas por los enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras. Cada de cadena ligero es ligada a una cadena pesada respectiva por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido por un numero de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en su otro extremo. El dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. El dominio constante de cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada. Los dominios constantes en las cadenas ligeras y pesadas no estan implicados directamente en la union del anticuerpo al antigeno.

Los dominios variables de cada par de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de union de antigeno. Los dominios variables en las cadenas ligeras y pesadas tienen la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones de la estructura, cuyas secuencias se conservan relativamente, conectadas por tres regiones de determinacion de complementariedad (CDRs) designadas frecuentemente como regiones hipervariables. Las cuatro regiones de la estructura adoptan en gran parte un orden de lamina beta y las CDRs forman bucles conectados, y en algunos casos forman parte de la estructura de lamina beta. Las CDRs son mantenidas en proximidad cercana por las regiones de la estructura y, con las CDRs del otro dominio, contribuyen a la formacion del sitio de union de antigeno. Las CDRs y las regiones de estructura de los anticuerpos se pueden determinar por referencia a Kabat y col. ("Sequences of proteins of immunological interest" US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987) .

Se ha informado que un anticuerpo monoclonal de murino, IN-1, que fue producido contra NI-220/250, una proteina de mielina que es un inhibidor potente del crecimiento de exson (y mostrada posteriormente como un fragmento de NOGO-A) , promueve la regeneracion axonal (Caroni, P y Schwab, ME (1988) Neuron 1 85-96; Schnell, L y Schwab, ME (1990) Nature 343 269-272; Bregman, BS y col. (1995) Nature 378 498-501 y Thallmair, M y col. (1998) Nature Neuroscience 1 124-131 ) . Tambien se ha informado que NOGO-A es el objetivo de IN-1 (Chen y col. (2000) Nature 403 434-439) . La administracion del fragmento IN-1 Fab o IN-1 humanizado a las ratas que han experimentado el corte transversal de la medula espinal, mejoro la recuperacion (Fiedler, M y col. (2002) Protein Eng 15 931-941; Brosamle, C y col. (2000) J. Neuroscience 20 8061-8068) .

Los anticuerpos monoclonales que se unen a NOGO se describen en los documentos WO 04/052932 y WO2005028508. El documento WO 04/052932 divulga un anticuerpo de murino 11 C7 que se une a ciertas formas de NOGO humana con alta afinidad.

Es deseable aislar y desarrollar los anticuerpos monoclonales terapeuticamente utiles adicionales que se unen a, e inhiben la actividad de, NOGO humana. El proceso de la neurodegeneracion es la base de muchas enfermedades/trastornos neurologicos incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades agudas tal como infarto cerebral (isquemico o hemorragico) , lesion cerebral traumatica y lesion de la medula espinal asi como enfermedades... [Seguir leyendo]

REIvINDICACIoNES

1, - Un anticuerpo monoclonal que se une a NOGO humana y la neutraliza, comprendiendo el anticuerpo una region variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoacidos SEC ID: NO: 86, SEC ID: NO: 88, SEC ID: NO: 89 o SEC ID: NO: 90 y una region de cadena ligera, que tiene una secuencia de aminoacidos de SEC ID: NO: 23 o

SEC ID: NO: 25, o una variante correspondiente que comprende un analogo de una region de determinacion de complementariedad (CDR) de dicho anticuerpo, en el cual dicha variante mantiene la especificidad de union y la capacidad de neutralizacion del anticuerpo del que se deriva,

2, - Un anticuerpo monoclonal segun la reivindicacion 1, que comprende regiones VH y VL seleccionadas en la siguiente lista H20L16 (SEQ ID 86 + SEQ ID 23) , H22L16 (SEQ ID 88 + SEQ ID 23) , H23L16 (SEQ ID 89 + SEQ ID

10 23) , H24L16 (SEQ ID 90 + SEQ ID 23) , H20L18 (SEQ ID 86 + SEQ ID 25) , H22L18 (SEQ ID 88 + SEQ ID 25) , H23L18 (SEQ ID 89 + SEQ ID 25) , y H24L18 (SEQ ID 90 + SEQ ID 25) .

3, - Una celula huesped co-transfectada con un primer y un segundo vectores que codifican las cadenas pesada y ligera, respectivamente, de un anticuerpo segun la reivindicacion 1 o 2,

4, - Una celula huesped transfectada con un vector que codifica las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo segun la reivindicacion 1 o 2,

5, - Un procedimiento de produccion de un anticuerpo segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende la etapa de cultivar una celula huesped segun la reivindicacion 3 o 4, y en recuperar el anticuerpo asi producido,

6, - Un anticuerpo segun la reivindicacion 1 o 2 producido por el procedimiento de la reivindicacion 5,

7, -Composiciones farmaceuticas que comprenden un anticuerpo anti-NOGO o un fragmento funcional correspondiente, segun las reivindicaciones 1, 2 o 6 junto con un diluyente o excipiente farmaceuticamente aceptable,

8, - Un anticuerpo segun la reivindicacion 1, 2 o 6 para su uso en el tratamiento o la profilaxis de un paciente humano,

Figura 2