Anticuerpo monoclonal específico para un polipéptido, péptido,

o variante que se encuentra de manera natural, deGPVI seleccionado de OM1, OM2, OM3 y OM4

en el que dicho OM1 comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) caracterizadas por lasSEC ID Nos: 1-3 en una primera cadena de anticuerpo y tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 4-6 en unasegunda cadena de anticuerpo;

en el que dicho OM2 comprende tres CDR caracterizadas por las SEC 10 ID Nos: 7-9 en una primera cadena deanticuerpo y tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 10-12 en una segunda cadena de anticuerpo;

en el que dicho OM3 comprende tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 13-15 en una primera cadena deanticuerpo y tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 16-18 en una segunda cadena de anticuerpo;

en el que dicho OM4 comprende tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 19-21 en una primera cadena deanticuerpo y tres CDR caracterizadas por la SEC ID Nos: 22-24 en una segunda cadena de anticuerpo.

Anticuerpos específicos contra la glicoproteína VI y procedimientos de producción de estos anticuerpos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad para la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/566.171, presentada el 29 de abril del 2004.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos generados contra la glicoproteína VI (GPVI) , fragmentos, o sus variantes de origen natural, de la membrana de las plaquetas, a métodos para producir los anticuerpos anti-GPVI y al uso de estos anticuerpos como agentes para la investigación e inmunoterapéuticos, en particular, como agentes terapéuticos para el tratamiento de la trombosis y de otras enfermedades vasculares.

Antecedentes de la invención

Las plaquetas son células sanguíneas pequeñas, anucleares, esenciales para el control hemostático y la cicatrización de heridas. En condiciones normales las plaquetas circulantes son bastante inactivas. Sin embargo, cuando un vaso sanguíneo se rompe o resulta dañado, las plaquetas se exponen a diversos factores que instigan programas celulares interconectados y complicados que conducen a la coagulación sanguínea y a la formación de coágulos, lo cual que se revisa en Mechanisms of Platelet Activation y Control, K. S. Authl, S. P. Watson, y V. V. Kakar (eds.) Plenum Press, 1993. La activación de estos programas celulares da como resultado aumentos drásticos en las propiedades adhesivas de la membrana, la agregación plaquetaria, y la liberación de factores vasoconstrictores y fibrinolíticos. Como consecuencia, en el sitio del traumatismo se forma un coágulo, obstruyendo cualquier fisura en la pared del vaso y proporcionando un sustrato para la invasión de fibroblastos y la reparación.

Los primeros sucesos en el proceso de coagulación pueden separarse funcionalmente en dos componentes primarios: la adhesión y la activación. La adhesión es el proceso de “pegar” plaquetas en la pared vascular dañada, mientras que la activación inicia cambios fisiológicos complejos en el interior de la célula. En su conjunto, estos dos procedimientos dan como resultado la agregación plaquetaria, la formación de un tapón, y finalmente, y un coágulo maduro. Aunque estos sucesos son cruciales, limitando la pérdida de sangre en el lugar donde se produce el daño, la adhesión y la activación plaquetaria también pueden contribuir a la agravación de una patología. Por ejemplo, la coagulación puede causar la obstrucción de vasos sanguíneos enfermos, lo que conduce a isquemia y puede producir daños en tejidos vitales tales como el corazón y el cerebro. La doble función de las plaquetas en la homeostasis y trombogénesis se revisa en Ruggeri, Nature Medicine, 8: 1227-1234 (2002) .

La mayoría de las etapas en estos procesos depende de la interacción de ligandos extracelulares con receptores específicos integrados en la membrana celular de las plaquetas. In vivo, el primer cambio visible en el comportamiento de las plaquetas es la adhesión de estas a un área desnuda de endotelio que se produce por el daño endotelial. Entre los constituyentes micromoleculares que quedan expuestos al área desnuda de endotelio, se considera que el colágeno es el más reactivo con las plaquetas. El colágeno sustenta la adhesión plaquetaria mediante rutas directas e indirectas y también activa a las plaquetas iniciando la agregación plaquetaria y generando la actividad coagulante necesaria para la formación del tapón. Baumgartner, Thromb Haemost. 37: 1-16 (1977) .

El contacto inicial entre las plaquetas y el subendotelio implica la interacción del complejo de glicoproteína GPIb-V-IX-plaqueta con el factor von Willebrand (vWf) unido al subendotelio expuesto. Esta interacción parece ser un proceso reversible y es insuficiente para una adhesión estable, como se ilustra mediante el “rodamiento” de las plaquetas a lo largo de la pared de los vasos. Ruggeri, Nature Medicine, 8: 1227-1234 (2002) . Aunque la interacción con el vWf no inmoviliza completamente a las plaquetas circulantes, es esencial para la adherencia de las plaquetas en condiciones de flujo sanguíneo alto. La unión posterior irreversible de las plaquetas al colágeno subendotelial a través de la glucoproteína GPIa-IIa (conocida también como integrina C211) estabiliza el suceso de interacción del vWf, anclando firmemente la plaqueta a la pared del vaso. A diferencia del vWf, la adhesión del colágeno parece ser un proceso más lento y solo es eficaz en condiciones de flujo bajo, o después de que las plaquetas se hayan detenido parcialmente por interacciones del vWf. Además, la unión de GPIa-IIa induce el aplastamiento (propagación) de las plaquetas contra la pared de los vasos. La propagación promueve la unión de otros factores de adhesión subendotelial incluyendo la fibronectina, la vitronectina y la trombospondina. Estas interacciones posteriores a la propagación también estabilizan la adhesión de las plaquetas a la pared de los vasos.

GPIa-IIa es una integrina que comprende una subunidad alfa y beta. En su conformación normal, las integrinas tienen baja afinidad por su ligando natural pero pueden convertirse en receptores de alta afinidad a través de señales generadas por otros receptores celulares Nieswandt B y Watson SP. Blood 102: 449-461 (2003) . La estimulación de GPIa-IIa y otros receptores de colágeno induce una multitud de cambios fisiológicos. Entre estos se encuentran las propiedades de adhesión de la superficie celular modificadas que da como resultado la agregación plaquetaria y la secreción de diversos compuestos bioactivos. Estos compuestos incluyen el vasoconstrictor, epinefrina, y factores de procoagulantes, que activan la trombina y conducen a la polimerización del fibrinógeno en las hebras de fibrina de un coágulo maduro. Además, las plaquetas activas liberan ADP y tromboxano A2 (TXA2) . Estos poderosos factores trombogénicos amplifican la señal de activación inicial, reclutando plaquetas adicionales en el estado activado.

Además de GPIa-IIa, en la superficie celular de las plaquetas se expresan al menos dos receptores de colágeno distintos, concretamente, GPIV (CD36) y GPVI (revisado en Farndale RWetaL, J Thromb. Haemost 2: 561573, 2004) . Indicios de las funciones de estos receptores de colágeno plaquetarios proceden del estudio de variantes en pacientes humanos. Estudios de variantes en pacientes humanos sugieren que GPVI desempeña un papel principal en las interacciones plaqueta-colágeno mientras que la contribución de GPIV sigue siendo menor. Estos estudios también demostraron que un número sustancial de individuos que carecían de GPIa-IIa o GPVI presentaban tiempos de sangrado ligeramente prolongados en comparación con los que expresaban GPIa-GPIIa o GPVI. Además, generalmente las carencias de GPIa-IIa conducen a trastornos de sangrado más graves que las carencias de GPVI. Sin embargo, estos pacientes casi nunca presentan tendencia a sangrado grave, tal como el observado en individuos con el Síndrome de Bernard Soulier, producido por una carencia de GPIb, o con tromboastenia de Glanzmann, producida por una carencia de GPIIb-IIIa.

Las observaciones de variantes humanas, junto con recientes datos in vitro, sugieren que los tres receptores de colágeno actúan conjuntamente para mediar las interacciones colágeno-plaqueta. Actualmente es posible, por ejemplo, bloquear in vitro la actividad de cada receptor de colágeno con anticuerpos específicos para los sitios receptores del colágeno. Individualmente, cada anticuerpo inhibe parcialmente la adhesión de las plaquetas al colágeno y las combinaciones de anticuerpos por parejas son significativamente más inhibidoras, particularmente cuando GPIa-IIa y GPVI se inhiben simultáneamente. Además, estos estudios demuestran que GPIV, GPIa-IIa y GPVI contribuyen a la trombosis a través de dos rutas distintas, mecanísticamente distinguibles por la necesidad de cationes metálicos divalentes.

La información bioquímica y de secuencias indica que GPIa-IIa es un receptor de tipo integrina dependiente de cationes. En cambio, estudios bioquímicos revelan que GPIV y GPVI no necesitan cationes metálicos bivalentes y son, por tanto, de tipo no-integrina. De las clases de no integrina, observaciones de sujetos humanos sugieren claramente que GPVI es más importante que GPIV en el proceso de adhesión primario. De hecho, experimentos in vitro, en los que la función de GPIa-IIa se bloquea por quelación de los cationes bivalentes, anticuerpos dirigidos contra GPVI anulan completamente... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo monoclonal específico para un polipéptido, péptido, o variante que se encuentra de manera natural, de GPVI seleccionado de OM1, OM2, OM3 y OM4

en el que dicho OM1 comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) caracterizadas por las SEC ID Nos: 1-3 en una primera cadena de anticuerpo y tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 4-6 en una segunda cadena de anticuerpo;

en el que dicho OM2 comprende tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 7-9 en una primera cadena de anticuerpo y tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 10-12 en una segunda cadena de anticuerpo;

en el que dicho OM3 comprende tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 13-15 en una primera cadena de anticuerpo y tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 16-18 en una segunda cadena de anticuerpo;

en el que dicho OM4 comprende tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 19-21 en una primera cadena de anticuerpo y tres CDR caracterizadas por la SEC ID Nos.

2. 24 en una segunda cadena de anticuerpo.

2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado de los hibridomas que tienen los números de acceso PTA-5938, PTA-5939, PTA-5940 y PTA-5941 de la ATCC.

3. Un anticuerpo monoclonal humanizado específico para un polipéptido, péptido, o una variante que e encuentra de manera natural, de GPVI, seleccionado de OM1 humanizado, OM2 humanizado, OM3 humanizado y OM4 humanizado,

en el que dicho OM1 humanizado comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) caracterizadas por las SEC ID Nos: 1-3 en una primera cadena de anticuerpo y tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 4-6 en una segunda cadena de anticuerpo;

en el que dicho OM2 humanizado comprende tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 7-9 en una primera cadena de anticuerpo y tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nº: 10-12 en una segunda cadena de anticuerpo;

en el que dicho OM3 humanizado comprende tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 13-15 en una primera cadena de anticuerpo y tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 16-18 en una segunda cadena de anticuerpo;

en el que dicho OM4 humanizado comprende tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos: 19-21 en una primera cadena de anticuerpo y tres CDR caracterizadas por las SEC ID Nos.

2. 24 en una segunda cadena de anticuerpo.

4. Un hibridoma seleccionado de los hibridomas que tienen los números de acceso PTA-5938, PTA-5939, PTA-5940 y PTA-5941 de la ATCC

5. Una composición antitrombótica que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.

6. Un método para preparar una composición antitrombótica que comprende mezclar al menos un anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. El anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, para su uso en el tratamiento de una enfermedad vascular en un paciente, en el que el tratamiento inhibe la trombosis.

8. La composición de la reivindicación 5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad vascular en un paciente, en el que el tratamiento inhibe la trombosis.

9. Un kit que comprende, en un envase, al menos una dosis de una cantidad farmacéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citadas en la descripción