Antagonista de la leptina y método para la medida cuantitativa de la leptina.

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de un anticuerpo monoclonal,

dirigido al dominio extracelular del receptor de la leptina o la proteína de unión a la leptina caracterizado porque el anticuerpo o fragmento se selecciona del grupo que consiste en:

i) un anticuerpo monoclonal depositado con el número de registro DSM ACC 2618;

ii) un fragmento de anticuerpo de cadena única como se representa en SEQ ID NO: 6;

en el que dicho anticuerpo o fragmento desplaza a la leptina que está unida al receptor de la leptina o la proteína de unión a la leptina.

Antagonista de la leptina y método para la medida cuantitativa de la leptina Esta invención se refiere a anticuerpos o proteínas de fusión específicos, en particular al anticuerpo monoclonal depositado DSM ACC2618 o a una proteína de fusión dirigida a a un receptor de la leptina (leptina-R) o una proteína de unión a la leptina (leptina-BP) , así como al uso de este anticuerpo o proteína de fusión para análisis cuantitativo, para propósitos terapéuticos y para la preparación de fármacos terapéuticos. Además, la invención se refiere a un método para la determinación cuantitativa de la leptina en la muestra de proteínas de unión a la leptina solubilizadas o suspendidas usando DSM ACC 2618 o proteínas de fusión según la invención, así como a agentes de diagnóstico y kits (de diagnóstico) que contienen este anticuerpo o proteína de fusión.

La leptina (derivada del término griego leptos = delgado) es una hormona proteica que se segrega principalmente por las células grasas (adipocitos) . En 1994, la leptina (Zhang et al. (1994) Nature 372, 425) se descubrió como un producto genético del gen de la obesidad (gen ob) con un peso molecular de aprox. 16 kDa, formado por 146 aminoácidos. Juega un papel importante en el metabolismo energético (Friedman et al., (1998) Nature 395, 763770) . Además de su relevancia para el metabolismo energético, se ha descrito entretanto su contribución en la modulación de las células inmunocompetentes (Lord et al., (1998) Nature 394, 6696) o células hematopoyéticas (Sierra-Honigmann et al., (1998) Science 281, 1683-1686) así como una función permisiva en la inducción de la pubertad (Quinton et al., (1999) J Clin Endocrinol Metab 84 (7) , 2336-41) . La leptina también se ha asociado fuertemente con la diabetes y el fallo cardiaco crónico (CHF) (véase E.M. El-Bindar y y A.Z. Darwish, Volumen 7, Nos. 4/5, julio-septiembre 2001, 697-706) .

En ratones (ratón ob/ob) , la ausencia del gen de la leptina (ratón ob/ob) da lugar a un sobrepeso masivo (adipositas) . Debido al hecho de que la administración de la leptina a ratones ob/ob induce una toma de alimento reducida y finalmente una reducción del peso, se ha atribuido a la leptina alguna importancia como un supresor del apetito. De cualquier forma, la situación es mucho más compleja.

El efecto de la leptina está mediado por el receptor de la leptina (leptina-R) (Tartaglia et al., (1995) Cell 83 (7) , 126371) , activando así cascadas de señales intracelulares. El receptor de la leptina pertenece a la denominada clase I de la superfamilia de receptores de citoquinas. En muchos receptores de esta familia, una parte extracelular de los receptores de la leptina circula como una proteína de unión a la leptina en la sangre y éste es también el caso para el receptor de la leptina.

Los defectos del receptor de la leptina se identificaron como una causa de problemas de sobrepeso en los seres humanos (Clement et al., (1998) Nature 392, 398-401) . A la inversa, los pacientes que padecen anorexia nerviosa (apetito disminuido) aparentemente tienen niveles incrementados de leptina en relación con su masa grasa reducida. Por lo tanto, la determinación de la concentración de la leptina en muestras de sangre o de suero es una herramienta de diagnóstico importante para la clarificación de la causa subyacente a los trastornos alimentarios u obesidad extrema.

Como se ha mencionado anteriormente, El-Bindar y y Darwish (2001) han asociado fuertemente la leptina con la diabetes y el fallo cardiaco crónico (CHF) . El-Bindar y y Darwish (2001) investigaron la interacción de TNF-a, niveles de leptina e insulina en pacientes que padecen CHF. CHF constituye un síndrome complejo asociado con la alteración de varias funciones metabólicas y endocrinas. Existe una evidencia acumulada de que la pérdida de peso y la caquexia observadas en estadios avanzados de CHF constituyen un pronóstico pobre en pacientes que padecen éstos. En particular, se asume que un nivel incrementado de leptina en plasma está implicado en la debilidad asociada con el estadio tardío de fallo cardiaco. Además, el fallo cardiaco crónico se caracteriza por un estado de hiperinsulinemia (Swan et al., Journal of the American College of Cardiology, 1997, 30: 527-32) , en el que existe una pérdida llamativa tanto de tejido muscular como adiposo que da lugar a caquexia cardiaca manifiesta en estos pacientes (véase Cleland y Clark, European heart journal, 1998, 19: 1421-2) . Por lo tanto, la atención reciente se ha centrado en la actividad citoquina en CHF. Según El-Bindar y y Darwish (2001) , existe una elevación significativa de TNF-a en el estadio tardío de CHF. Aparentemente, el nivel de TNF-a circulante está elevado en pacientes con CHF avanzado. Se puede asumir que TNF-a puede contribuir a la progresión de la descompensación cardiaca que ocurre en los casos avanzados de CHF. Los resultados también revelan una correlación entre TNF-a y la concentración de leptina en plasma. TNF-a puede actuar directamente en los adipocitos para incrementar la producción del factor lipostático leptina, en el que el nivel de leptina en suero parecer estar bajo el control de TNF-a. Por lo tanto, existe una elevación significativa del nivel de insulina y una correlación con TNF-a en el estadio tardío de CHF. El-Bindar y y Darwish (2001) también encontraron evidencia para una correlación positiva entre la leptina plasmática y el nivel de insulina en la enfermedad de estadio tardío. La leptina plasmática incrementada y el incremento asociado de insulina se consideraron otro factor causante de caquexia. El incremento en los niveles plasmáticos de TNF-a, leptina e insulina y la correlación positiva entre ellos en fallo cardiaco en estadio tardío puede constituir uno de varios círculos viciosos de CHF de estadio avanzado.

Como los trastornos del metabolismo energético, en particular los trastornos alimentarios, tales como anorexia nerviosa (apetito disminuido) , se observan más frecuentemente, la identificación de antagonistas de leptina eficaces que puedan reducir, inhibir o incluso bloquear la función de la leptina, tiene un interés y una significancia económica importantes.

Por lo tanto, es un primer objeto de la presente invención proporcionar un antagonista de leptina-R y leptina-BP. Dicho antagonista puede ser adecuado en el tratamiento de enfermedades y/o síntomas asociados con niveles excesivos de leptina, tales como diabetes, caquexia, obesidad, fallo cardiaco crónico (CHF) , etc., así como en el desarrollo y suministro de un medicamento y/o terapias para dichas enfermedades.

Mediante el uso de antagonistas de leptina adecuados (como se ha mencionado anteriormente) , es posible examinar in vitro los mecanismos reguladores y efectos específicos de la leptina por la inhibición selectiva del receptor de la leptina y/o el desplazamiento de la leptina de las proteínas de unión a la leptina.

A la vista de lo anterior, la determinación cuantitativa de la leptina en una muestra y en particular en líquidos corporales fisiológicos - tales como por ejemplo sangre - es un prerrequisito para el tratamiento terapéutico y una herramienta de diagnóstico importante. Muchas, por ejemplo, hormonas u otras sustancias mensajeras (ligandos) , se unen específicamente a sus receptores de membrana, cuyo dominio o dominios extracelulares están frecuentemente solubilizados o suspendidos en el líquido. De esta manera, se forma un complejo compuesto por los ligandos a determinar, por ejemplo, leptina (ligando) y la proteína de unión a leptina, que influye (reduce) en el nivel del ligando libre en la muestra. Con el fin de evitar este problema, se usa un ligando marcado y añadido a la muestra. Sin embargo, la proteína de unión puede unirse al ligando marcado en la disolución y así el ligando no es detectable en la muestra. Por lo tanto, la proteína de unión interfiere con la medida cuantitativa del ligando y el diagnóstico.

Generalmente, los denominados inmunoensayos se usan para el análisis de la concentración de leptina. Se basan en el principio de una interacción de anticuerpos específicos con un analito. Alternativamente, se usan ensayos competitivos (tales como el radioinmunoensayo, RIA) , en los que la leptina marcada compite con la leptina presente en la muestra por el sitio de unión en un anticuerpo, generando así una señal que es inversamente proporcional a la concentración del analito que se va a determinar. Sin embargo, actualmente, se usan lo más frecuentemente los inmunoensayos en sandwich, en los que un anticuerpo específico inmovilizado se une al analito ("anticuerpo de captura") y posteriormente,... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de un anticuerpo monoclonal, dirigido al dominio extracelular del receptor de la leptina o la proteína de unión a la leptina caracterizado porque el anticuerpo o fragmento se selecciona del grupo que consiste en:

i) un anticuerpo monoclonal depositado con el número de registro DSM ACC 2618;

ii) un fragmento de anticuerpo de cadena única como se representa en SEQ ID NO: 6;

en el que dicho anticuerpo o fragmento desplaza a la leptina que está unida al receptor de la leptina o la proteína de unión a la leptina.

2. El anticuerpo monoclonal o fragmento según la reivindicación 1, caracterizado porque se une al sitio de unión de la leptina.

3. Un anticuerpo monoclonal o fragmento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, para usarse como un medicamento.

4. Una proteína de fusión, que contiene: i) un anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1 ó 2; y ii) un segundo anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un péptido o leptina.

5. La proteína de fusión según la reivindicación 4, caracterizada porque la proteína de fusión contiene un conector entre las partes i) y ii) .

6. La proteína de fusión según la reivindicación 5, caracterizada porque el conector comprende una longitud de 5 a 40 aminoácidos, más preferiblemente entre 5 y 30 aminoácidos y lo más preferiblemente entre 5 y 20 aminoácidos.

7. La proteína de fusión según las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizada porque el conector contiene al menos 50% de residuos de glicina, preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70% y lo más preferiblemente al menos 80%.

8. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4-7, caracterizada porque la proteína de fusión es biespecífica y está dirigida al receptor de la leptina o la proteína de unión de la leptina como una primera especificidad y a una proteína de la superficie celular como una segunda especificidad.

9. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4-8, caracterizada porque la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 7.

10. La proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 4-8, caracterizada porque la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8.

11. Un método para la determinación cuantitativa de leptina en una muestra que contiene leptina y el receptor de la leptina o la proteína de unión a la leptina en forma solubilizada o suspendida, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1 ó 2, y/o una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 410 se añade (n) a la muestra que se va a determinar.

12. El método según la reivindicación 11, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1 ó 2 se añade antes o durante la determinación cuantitativa y/o se incuba con la muestra.

13. El método según la reivindicación 11 ó 12, caracterizado porque la muestra contiene líquido.

14. El método según la reivindicación 13 en el que dicha muestra es un líquido corporal más preferiblemente líquido corporal humano.

15. El método según la reivindicación 13 ó 14 en el que dicha muestra es sangre.

16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-15, caracterizado porque la proteína de unión a la leptina es soluble, preferiblemente una parte soluble del receptor de la leptina y/o una proteína de unión a hormona, en particular una proteína de unión a hormona soluble.

17. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-16, caracterizado porque la determinación cuantitativa de la leptina se realiza usando la unión de la leptina como un antígeno a un anticuerpo.

18. El método según la reivindicación 17 en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

19. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-18, caracterizado porque la determinación cuantitativa se realiza usando un ensayo de unión competitiva.

20. El método según la reivindicación 19 en el que dicho ensayo es un radioinmunoensayo.

21. El método según una de las reivindicaciones 11-20, caracterizado porque la determinación cuantitativa se realiza por la medida de un parámetro de lectura creciente que se incrementa como función de la concentración del ligando que se va a determinar.

22. El método según la reivindicación 21 en el que dicho método es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) y/o un ensayo en sandwich.

23. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-22, caracterizado porque la proteína de unión a la leptina no se separa de la muestra que se va a determinar antes de la determinación cuantitativa.

24. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 11-23, caracterizado porque un anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1 ó 2 se añade a la muestra en una concentración más alta que la proteína de unión a la leptina, preferiblemente en una concentración de al menos 50% más, más preferiblemente de al menos 100%, incluso más preferiblemente de al menos 200% más, y lo más preferiblemente de al menos 400% más.

25. Un medicamento que contiene un anticuerpo o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, o una proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 4-10.

26. Un agente de diagnóstico que contiene un anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1 ó 2, o una proteína de fusión según una de las reivindicaciones 4-6.

27. Un kit que contiene: un anticuerpo o fragmento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, o una proteína de fusión según una de las reivindicaciones 4-6.

28. El kit según la reivindicación 27, caracterizado porque el kit contiene además un anticuerpo monoclonal de la leptina.

29. El kit según la reivindicación 28, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal de la leptina está dirigido a la isoforma principal de la leptina con un peso molecular de 16 kDa.

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