Animal transgénico y método para su producción.

Animal no humano, transgénico que contiene:

(a) en todas las células diploides,

una primera secuencia de ADN para la expresión de una proteína a partir de un gen bajo el control del promotor de tetraciclina (promotor de Tet); y

(b) en la circunvolución dentada del hipocampo, un segundo ADN que se ha introducido mediante inyección de un lentivirus que lo comprende en la circunvolución dentada del hipocampo, siendo dicho segundo ADN para la expresión del gen rtTA bajo el control de un promotor específico para la circunvolución dentada del hipocampo, de modo que la expresión del rtTA induce la expresión de la proteína codificada por la primera secuencia de ADN en este tejido diana.

Animal transgénico y método para su producción El objeto de la presente invención es un mamífero transgénico, no humano, y un método para su obtención, que puede servir para producir una herramienta de investigación favorable.

Durante muchos años, animales, particularmente roedores de laboratorio tales como ratas y ratones, han compuesto modelos usados para estudiar los mecanismos de muchos procesos fisiológicos, así como la patogénesis de diversas enfermedades. La rata de laboratorio es un ejemplo particular, que ha sido el modelo de investigación líder en neurobiología, fisiología, farmacología, toxicología y muchas otras ciencias biomédicas durante más de 100 años. Con mucha frecuencia, el modelo preferido es un animal transgénico. La producción de mamíferos transgénicos se logró por primera vez en ratones. El método (tradicional) bien conocido para obtener mamíferos transgénicos, por ejemplo ratas, es una adaptación de métodos anteriores desarrollados para ratones y se basa en el aislamiento de óvulos fertilizados (embriones unicelulares) de oviductos femeninos tras superovulación inducida y copulación (Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F., y Lacy, E. (1994) . Manipulating the Mouse Embr y o: A Laborator y Manual, segunda edición. Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor) y el uso de métodos in vitro para introducir ADN foráneo en embriones unicelulares aislados. Posteriormente, los embriones modificados se mantienen hasta la fase bicelular y se introducen en los oviductos de madres sustitutas, que son hembras falsamente preñadas (descripción detallada de cada fase en: Methods in Molecular Biology, vol. 18: Transgenesis Techniques: Principles and Protocols, D. Murphy y A. Carter, Humana Press Inc., Totowa, NJ) . Las madres sustitutas se obtienen usando la copulación con machos estériles (sometidos a vasectomía) . El estado de la técnica está repleto de ejemplos de modelos transgénicos obtenidos usando el método descrito anteriormente o sus desarrollos.

La patente US5489742 reivindica un modelo de rata de artritis reumatoide. Se usó el método tradicional para obtener ratas transgénicas. Las líneas de ratas transgénicas son LEW y F344. Se provoca la superovulación mediante un goteo continuo de FSH (véase también: Armstrong, D. T. y Opavsky, M. A. (1988) . Superovulation of immature rats by continuous infusion of follicle-stimulating hormone. Biol. Reproduct. 39, 511-518) . Se transfirieron los embriones inmediatamente antes de la microinyección (fase unicelular) . Se usaron hembras Sprague-Dawley que habían copulado con machos sometidos a vasectomía como madres sustitutas.

La descripción del documento EP0683226 describe sólo la transgénesis de ratones. Se empleó un procedimiento convencional usando hembras falsamente preñadas como madres sustitutas.

La solicitud WO9314200 describe un modelo animal de Alzheimer. Se describió la transgénesis tanto de ratas como de ratones. En el caso de ratones, la técnica se basa en la modificación de células madre embrionarias (ES) . La transgénesis de las ratas se produce a lo largo de una ruta esencialmente tradicional. Para la transgénesis se usó la línea de rata Sprague-Dawley. Se provocó la superovulación mediante una única inyección subdérmica de PMSG sin el uso de GCh. Se transfirieron los embriones inmediatamente tras la microinyección. Se usaron hembras Sprague-Dawley falsamente preñadas como madres sustitutas. En el texto se describe un procedimiento para obtener ratas, pero parece evidente que sólo se obtuvieron ratones.

La descripción de la patente PL355353 revela un método mejorado para obtener ratas transgénicas usando microinyecciones de ADN en el pronúcleo del cigoto.

Los métodos mencionados anteriormente para introducir un sistema completo de expresión regulada en un animal usando transgénesis no es útil para el sistema nervioso central. Los sistemas citados actúan simultáneamente en varios tejidos, lo que significa que no son útiles en el estudio de los efectos locales de los genes introducidos, tal como su actividad en el cerebro. Por tanto, todavía existe una necesidad real de obtener animales transgénicos que tengan la capacidad de inducir la expresión local de un gen, particularmente en el tejido nervioso.

El problema indicado se ha solucionado inesperadamente en la presente invención.

El objeto de la presente invención es un animal no humano, transgénico que contiene:

(a) en todas las células diploides, una primera secuencia de ADN para la expresión de una proteína a partir de un gen bajo el control del promotor de tetraciclina (promotor de Tet) ; y

(b) en la circunvolución dentada del hipocampo, un segundo ADN que se ha introducido mediante inyección de un lentivirus que lo comprende en la circunvolución dentada del hipocampo, siendo dicho segundo ADN para la expresión del gen rtTA bajo el control de un promotor específico para la circunvolución dentada del hipocampo, de modo que la expresión del rtTA induce la expresión de la proteína codificada por la primera secuencia de ADN en su tejido diana.

El siguiente objeto de la presente invención es un método para obtener un animal no humano transgénico, caracterizado porque se introducen dos secuencias de ADN en las células del animal, en el que:

(a) se introduce el primer ADN en todas las células diploides del animal, siendo dicho primer ADN para la expresión

de una proteína a partir de un gen bajo el control del promotor de tetraciclina (promotor de Tet) ;

(b) se introduce el segundo ADN mediante inyección de un lentivirus que lo comprende en la circunvolución dentada del hipocampo del animal obtenido en (a) , o de una progenie del mismo que lleva dicha primera secuencia de ADN; siendo dicho segundo ADN para la expresión del gen rtTA bajo el control de un promotor específico para la circunvolución dentada del hipocampo.

Preferiblemente, la etapa de introducir el primer ADN implica microinyección de ADN en un pronúcleo cigótico.

Preferiblemente, dicho promotor específico para la circunvolución dentada es el promotor EF1alfa.

Preferiblemente, la proteína codificada por el primer ADN es EGFP.

La descripción de la presente invención se ha complementado con las siguientes figuras:

la figura 1 representa un esquema de un experimento que conduce a la expresión inducible de EGFP en la circunvolución dentada del hipocampo de rata, TetP-EGFP. (A) Ratas transgénicas TetP-EGFP/hip-LV-EF1a-rtTA-TetP-EGFP con el vector lentiviral LV-EF1a-rtTA introducido en la circunvolución dentada. DOX-doxiciclina (2 mg/ml) administrada en agua de bebida durante 14 días. (B) Sección transversal de un cerebro de rata a -3, 14 del bregma (Paxinos y Watson, 1998) . La flecha roja indica el sitio de inyección del vector lentiviral;

la figura 2 representa la expresión inducible del gen EGFP en la circunvolución dentada de una rata TetP-EGFP/hip-LV-EF1!-rtTA. (A) Presenta imágenes de secciones transversales del cerebro de una rata TetP-EGFP tras la introducción del vector lentiviral LV-EF1!-rtTA. Se les administró a las ratas doxiciclina (2mg/ml, 14 días) (panel inferior) . El panel superior muestra secciones de tejido control (sin doxiciclina) . (B) Una ampliación de la circunvolución dentada de ratas TetP-EGFP/hip-LV-EF1!-rtTA (con doxiciclina) marcada en (A) (panel superior) . Tinción fluorescente para el marcador neuronal NeuN y para las células de la astroglía, GFAP (panel inferior) . Se tiñeron las secciones con DAPI para visualizar los núcleos celulares.

Ejemplo 1 - Obtención de ratas transgénicas Con el fin de obtener ratas transgénicas, se usó un método mejorado de microinyección de ADN en el pronúcleo del cigoto descrito en la solicitud de patente PL355353 presentado ante la Oficina de Polaca Patentes (Kaczmarek et al., 2002) . Se usaron cepas de rata Wistar y Brown Norway (BN) .

Con el fin de obtener un gran número de cigotos para la microinyección de ADN, se les administraron a ratas hembra Wistar de 5-6 semanas de edad 20 UI de PMSG (gonadotrofina sérica de yegua preñada) con el fin de estimular los folículos ováricos. Tras 52 h, se administraron 35 UI de GCh (gonadotrofina coriónica humana) con el fin de estimular la maduración y ovulación de los ovocitos. A continuación, las hembras se aparearon con machos Wistar maduros. Al día siguiente, se aislaron ovocitos fertilizados de los oviductos de hembras que tenían esperma en sus frotis vaginales.... [Seguir leyendo]

1. Animal no humano, transgénico que contiene:

(a) en todas las células diploides, una primera secuencia de ADN para la expresión de una proteína a partir de un gen bajo el control del promotor de tetraciclina (promotor de Tet) ; y (b) en la circunvolución dentada del hipocampo, un segundo ADN que se ha introducido mediante inyección de un lentivirus que lo comprende en la circunvolución dentada del hipocampo, siendo dicho segundo ADN para la expresión del gen rtTA bajo el control de un promotor específico para la circunvolución dentada del hipocampo, de modo que la expresión del rtTA induce la expresión de la proteína codificada por la primera secuencia de ADN en este tejido diana.

2. Método para obtener un animal no humano transgénico, caracterizado porque se introducen dos secuencias de ADN en las células del animal, en el que:

(a) se introduce el primer ADN en todas las células diploides del animal, siendo dicho primer ADN para la expresión de una proteína a partir de un gen bajo el control del promotor de tetraciclina (promotor de Tet) ;

(b) se introduce el segundo ADN mediante inyección de un lentivirus que lo comprende en la circunvolución

dentada del hipocampo del animal obtenido en (a) , o de una progenie del mismo que lleva dicha primera secuencia de ADN; siendo dicho segundo ADN para la expresión del gen rtTA bajo el control de un promotor específico para la circunvolución dentada del hipocampo.

3. Animal de la reivindicación 1 o método de la reivindicación 2, en el que la etapa de introducir el primer ADN implica microinyección de ADN en un pronúcleo cigótico.

4. Animal de la reivindicación 1 o método de la reivindicación 2, en el que dicho promotor específico para la circunvolución dentada es el promotor EF1alfa.

5. Animal de la reivindicación 1 o método de la reivindicación 2, en el que la proteína codificada por el primer ADN es EGFP.