Un método para amplificar una secuencia o señal de ácido nucleico diana,

en el que se usa una mezcla de reacción de amplificación que contiene al menos un oligonucleótido modificado reversiblemente que tienen un extremo 3' distinto de un grupo hidroxilo que puede convertirse en un extremo 3' hidroxilo después de exposición a un compuesto químico y un intervalo de temperatura.

Amplificación de ácidos nucleicos usando un oligonucleótido modificado reversiblemente.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en general al campo de la química de ácidos nucleicos. Más específicamente, se refiere a métodos para amplificar secuencias o señales de ácidos nucleicos y a métodos para reducir la amplificación no específica.

ANTECEDENTES

Las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos se usan ampliamente en microbiología clínica, cribado de sangre, seguridad alimentaria, diagnóstico y pronóstico de enfermedades genéticas, microbiología medioambiental, descubrimiento y validación de fármacos diana, medicina forense y otras investigaciones biomédicas. La robustez, especificidad, sensibilidad, fiabilidad, en términos de exactitud y precisión, y asequibilidad de la amplificación de los ácidos nucleicos tienen una importancia particular.

La amplificación específica de secuencias de ácidos nucleicos permite la detección sensible de la presencia de una secuencia específica. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la reacción en cadena de la ligasa (LCR) son dos tecnologías de amplificación de termociclado.

A diferencia de PCR y LCR, la amplificación isotérmica se refiere a una categoría de amplificación en la que la amplificación se realiza a una temperatura sustancialmente constante. La amplificación mediada por transcripción (TMA) , amplificación basada en la secuencia de los ácidos nucleicos (NASBA) , amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) , amplificación con círculo rodante (RCA) , amplificación isotérmica con un único cebador (SPIAN) y amplificación isotérmica con un único cebador exponencial (X-SPIAN) , replicación de secuencia auto-sostenible (3SR) y amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) son ejemplos de amplificación isotérmica. La secuencia de ácido nucleico también puede detectarse mediante un proceso de amplificación de la señal, tal como sonda cíclica o ensayo invasor. La señal detectable se genera por la escisión con nucleasa de la sonda hibridada.

Como todas las enzimas, independientemente de su termoestabilidad, son activas en un intervalo de temperatura, dicha propiedad podría afectar de manera adversa la amplificación del ácido nucleico en términos de especificidad, sensibilidad y relación señal/ruido etc. Esto se ha demostrado claramente en el proceso de PCR. Una ADN polimerasa termoestable es esencial para una PCR. Aunque la temperatura óptima de la actividad catalítica de una ADN polimerasa termoestable es alrededor de 60º750C, también es activa a temperatura baja. Retiene una actividad significativa incluso a temperatura ambiente. Su actividad a temperatura baja es una causa de la formación de dímeros de cebador, amplificación no específica y sensibilidad reducida de la detección.

El rendimiento de la PCR de ADN se mejora empleando tecnologías de arranque en caliente. "Arranque en caliente" se refiere a cualquier método para ensamblar reacciones de PCR que mantiene uno o más de los componentes de la reacción físicamente o funcionalmente separados del resto de los componentes a temperatura baja y que permite el inicio de las reacciones a una temperatura elevada. Las tecnologías de PCR de arranque en caliente pueden clasificarse en los grupos siguientes:

1. Barrera física para dividir todos los componentes esenciales en al menos dos compartimentos como se describe en las Pat. US Nos. 5.411.876, 5.565.339; 5.413.924 y 5.643.764. La barrera se elimina calentando a temperatura elevada.

2. Inhibidores reversibles de la enzima para suprimir la actividad de la enzima a temperatura baja como se describe en las Pat. US Nos. 5.338.671; 5.677.152; 5.773.258; 6.183.998; 5.693.502, 5.874.557, 5.763.173, 6.020.130 y

6.183.967. La unión del inhibidor es bien no covalente o covalente. El arranque en caliente por estos métodos es homogéneo y es el usado más ampliamente.

3. Separación de fase del cofactor como se describe en la Pat. US No. 6.403.341. El Mg2+ se precipita a temperatura baja y se vuelve soluble al aumentar la temperatura.

La RT PCR en una etapa es un proceso para amplificar ARN diana combinando la molécula de ARN que se transcribe de manera inversa y amplificando la molécula de ADN complementario en un vial. Las moléculas de ARN diana incluyen VIH, HCV, Virus del Nilo Oeste (WNV) , virus de influenza humana, virus de la gripe aviar, virus delDengue, Virus de Ébola etc. En los Estados Unidos, es obligatorio ensayar la presencia de VIH, HBV, HCV y WNV en la sangre de donantes. El rendimiento de la RT PCR en una etapa es crítico para estos ensayos clínicos y el cribado de sangre. Desafortunadamente ninguna de las tecnologías de arranque en caliente existentes puede aplicarse bien en este proceso porque:

1. La mayoría de las transcriptasas inversas, la enzima clave para la transcripción inversa, no pueden ser una diana para el proceso de arranque en caliente porque no son termoestables y perderían actividad después de la incubación a temperatura alta.

2. La molécula de ARN, la materia del ensayo, no es estable y experimenta una degradación significativa a temperatura alta. La presencia de iones metálicos divalentes, tales como Mg2+, hace que la degradación sea más severa. Ninguna de las tecnologías existentes podría aplicarse sin dañar las moléculas de ARN diana.

3. La incubación durante mucho tiempo del proceso de transcripción inversa, habitualmente 30 minutos o más, incrementa tremendamente la posibilidad de tener reacciones laterales que podrían reducir dramáticamente la sensibilidad de la detección. Esto muestra que la tecnología de arranque en caliente basada en inhibidor de la enzima no mejoraría el rendimiento de la RT PCR en una etapa.

Debido a la importancia práctica de la amplificación de los ácidos nucleicos, existe una fuerte demanda de una nueva tecnología que pueda mejorar el rendimiento de la reacción de amplificación de los ácidos nucleicos, especialmente la RT PCR en una etapa. En esta aplicación se describe un nuevo comienzo controlado de la reacción de amplificación de ácidos nucleicos.

US 6.509.157 describe un método para amplificar una secuencia diana de ácido nucleico, en el que dicho método comprende realizar una reacción de amplificación usando un par de cebadores, en el que al menos un cebador de dicho par se bloquea reversiblemente por la unión covalente de un grupo triarilmetilo en el OH del 3' terminal. En este documento, el cebador bloqueado se revirtió con calor.

WO 02/100873 describe el uso de oligonucleótidos protegidos que se refiere a oligonucleótidos que están modificados por modificación química reversible. Los grupos protectores usados incluyen trimetoxitritilo, dimetoxitritilo, monometoxitritilo, 9-fenilxanten-9-ilo y 9- (p-metoxifenil) xanten-9-ilo.

US 6.355.432 describe que uno de los grupos protectores 3'-O más comunes es el éster en particular el acetato. Describe además que estos grupos pueden eliminarse por tratamiento con base suave.

WO 94/04548 describe una modificación química reversible de oligonucleótidos aplicable al ciclo de aptámero. La modificación de enlaces específicos se define por el uso de uno o más análogos de nucleósido trifosfato apropiados como se ejemplifica por un tio-2'-dioxinucleósido trifosfato. Después del ciclo de amplificación, el oligonucleótido se modifica químicamente en el núcleo. Los oligonucleótidos modificados se someten a su ciclo de selección. Los oligonucleótidos modificados seleccionados se convierten de nuevo en oligonucleótidos no modificados seguido de amplificación por métodos estándar tal como PCR.

WO 96/07669 describe un método para sintetizar un polinucleótido de una secuencia predeterminada, método que comprende las etapas de: a) proporcionar un sustrato de inicio que comprende un nucleósido que tiene un grupo hidroxilo no protegido en 3'; y b) hacer reaccionar bajo condiciones enzimáticas en presencia de una cantidad catalítica de una enzima dicho grupo hidroxilo en 3' de dicho sustrato de inicio con un nucleósido 5'-trifosfato que tiene un resto bloqueante eliminable que protege la posición 3' de dicho nucleósido 5'-trifosfato y seleccionado según el orden de dicha secuencia predeterminada, mediante lo cual dicha enzima cataliza la formación de un enlace fosfodiéster 5' a 3' entre dicho grupo hidroxilo en 3' no protegido de dicho sustrato de inicio y el 5'-fosfato de dicho nucleósido 5'-trifosfato para producir dicho polinucleótido.

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1. Un método para amplificar una secuencia o señal de ácido nucleico diana, en el que se usa una mezcla de reacción de amplificación que contiene al menos un oligonucleótido modificado reversiblemente que tienen un extremo 3' distinto de un grupo hidroxilo que puede convertirse en un extremo 3' hidroxilo después de exposición a un compuesto químico y un intervalo de temperatura.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene el ácido nucleico diana con una mezcla de reacción de amplificación que contiene al menos un oligonucleótido modificado reversiblemente, en el que dicho oligonucleótido modificado reversiblemente tiene un extremo 3' distinto de un grupo hidroxilo que puede convertirse en un extremo 3' hidroxilo después de exposición a un compuesto químico y un intervalo de temperatura;

(b) exponer la mezcla de la etapa (a) a dicho compuesto químico y dicho intervalo de temperatura durante un tiempo suficiente para regenerar el extremo 3' hidroxilo; y

(c) llevar a cabo la reacción de amplificación.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico es ácido ribonucleico, comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene el ácido ribonucleico diana con una mezcla de reacción de amplificación que contiene al menos un primer oligonucleótido modificado reversiblemente, en el que el primer oligonucleótido modificado reversiblemente tiene un extremo 3' distinto de un grupo hidroxilo que puede convertirse en un extremo 3' hidroxilo después de exposición a un primer compuesto químico y un primer intervalo de temperatura;

(b) incubar la mezcla de la etapa (a) bajo condiciones que permitan la transcripción inversa del ácido ribonucleico;

(c) exponer la mezcla de la etapa (b) a dicho primer compuesto químico y dicho primer intervalo de temperatura durante un tiempo suficiente para regenerar el extremo 3' hidroxilo del primer oligonucleótido modificado reversiblemente; y

(d) llevar a cabo la reacción de amplificación para formar productos de extensión del cebador.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la mezcla de reacción de amplificación comprende además al menos un segundo oligonucleótido modificado reversiblemente, en el que el segundo oligonucleótido modificado reversiblemente tiene un extremo 3' distinto de un grupo hidroxilo que puede convertirse en un extremo 3' hidroxilo después de exposición a un segundo compuesto químico y un segundo intervalo de temperatura; y en el que el método comprende además una etapa de exposición de la mezcla de la etapa (a) a dicho segundo compuesto químico y dicho segundo intervalo de temperatura durante un tiempo suficiente para regenerar el extremo 3' hidroxilo del segundo oligonucleótido modificado reversiblemente antes de la etapa (b) .

5. El método de la reivindicación 3, que es un proceso de RT-PCR en una etapa con un sistema de dos enzimas, en el que al menos se usan una transcriptasa inversa y una ADN polimerasa termoestable, o con un sistema de una enzima, en el que sólo se usa una enzima que funciona tanto como transcriptasa inversa como ADN polimerasa.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el oligonucleótido modificado reversiblemente tiene un grupo éster de ácido carboxílico en su extremo 3', el éster de ácido carboxílico se selecciona del grupo que consiste en éster de formato, éster de benzoilformato, éster de haloacetato, éster de metoxiacetato, éster de trifenilmetoxiacetato, éster de fenoxiacetato, éster de maleato y sus derivados, éster de succinato y sus derivados, éster de 4-oxopentanoato, éster de pivaloato, éster de crotonato, éster de 4-metoxicrotonato y 3-fenilpropionato.

7. El método de la reivindicación 6, en el que para regenerar el grupo hidroxilo en 3' se usa un compuesto químico en combinación con incubación a un intervalo de temperatura, el compuesto químico se selecciona del grupo que consiste en azida, imidazol, piridina, hidroxilamina, hidrazina e hidróxido de tetrabutilamonio.

8. El método de la reivindicación 6, en el que el éster de ácido carboxílico es éster de ácido maleico y se usa hidroxilamina o hidrazina para regenerar el grupo hidroxilo en 3' después de incubación a un intervalo de temperatura.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el oligonucleótido modificado reversiblemente tiene un grupo éter de sililo, que se selecciona del grupo que consiste en éter de trimetilsililo, éter de trietilsililo, éter de triisopropilsililo, éter de dimetilisopropilsililo, éter de dietilisopropilsililo, éter de dimetilhexilsililo, éter de tbutildimetilisililo, éter de t-butildifenilsililo, éter de tribencilsililo, éter de tri-p-xililsililo, éter de trifenilsililo, éter de difenilmetilsililo y éter de t-butilmetoxifenilsililo, en su extremo 3'.

10. El método de la reivindicación 9, en el que se usa un fluoruro, que se selecciona del grupo que consiste en fluoruro de tetrabutilamonio, fluoruro de sodio, fluoruro de potasio, fluoruro de litio y ácido fluorhídrico para regenerar el grupo hidroxilo en 3'.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el oligonucleótido modificado reversiblemente tiene un grupo éter en su extremo 3', el éter se selecciona del grupo que consiste en éter de tetrahidrofuranilo, éter de alilo, éter de p-metoxifenilo, éter de p-metoxibencilo, éter de 3, 4-dimetoxibencilo, éter de (4-metoxifenoxi) metilo, éter de metoxietoximetilo, éter de metoximetilo, éter de guayacolmetilo, éter de tetrahidropiranilo, éter de tetrahidrotiofuranilo, éter de siloximetilo o éter de 2- (trimetilsilil) etoximetilo, éter de 2- (trimetilsilil) etoximetilo y éter de metilo.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el éter es éter de alilo y se usa un catalizador de paladio o rodio para regenerar el grupo hidroxilo en 3'.

13. El método de la reivindicación 11, en el que el éter es éter de p-metoxifenilo o p-metoxibencilo o éter de 3, 4dimetoxibencilo o éter de (4-metoxifenoxi) metilo y se usa nitrato cérico amónico para regenerar el grupo hidroxilo en 3'.

14. El método de la reivindicación 11, en el que el éter se selecciona del grupo que consiste en éter de metoxietoximetilo, éter de metoximetilo, éter de guayacolmetilo, éter de tetrahidropiranilo y éter de tetrahidrotiofuranilo y se usa un catalizador ácido de Lewis para regenerar el grupo hidroxilo en 3'.

15. El método de la reivindicación 11, en el que el éter es éter de siloximetilo o éter de 2- (trimetilsilil) etoximetilo y se usa fluoruro para regenerar el grupo hidroxilo en 3'.

16. El método de la reivindicación 11, en el que el éter es éter de 2- (trimetilsilil) etoximetilo y se usa LiBF4 y/o fluoruro para regenerar el grupo hidroxilo en 3'.

17. El método de la reivindicación 11, en el que el éter es éter de metilo y se usa uno o más compuestos químicos seleccionados del grupo que consiste en BBr3, SiCl4, NaI y AIX3 para regenerar el grupo hidroxilo en 3'.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para uso en ensayo invasor, reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la ligasa, amplificación con círculo rodante, amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación mediada por transcripción, amplificación basada en secuencia de ácido nucleico, replicación de secuencia auto-sostenible, amplificación isotérmica con un único cebador, amplificación isotérmica con un único cebador exponencial o amplificación mediada por bucle.