Agentes de unión biespecíficos específicos de especies cruzadas.

Un polipéptido que comprende un primer dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopode la cadena CD3ε

humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que el epítopo formaparte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 ycomprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu, y un segundo dominio de unión capaz deunirse a EGFR, Her2/neu o IgE de un ser humano y/o de un primate distinto de chimpancé.

Agentes de unión biespecíficos específicos de especies cruzadas

La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende un primer dominio de unión humano que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de CD3 (épsilon) humana y de primate distinto de chimpancé y un segundo dominio de unión capaz de unirse a EGFR, Her2/neu o IgE de un ser humano y/o un primate distinto de chimpancé, así como a un procedimiento para la producción del polipéptido mencionado. La invención se refiere además a ácidos nucleicos que codifican el polipéptido, a vectores que lo comprenden y a células huésped que comprenden el vector. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido mencionado y usos médicos del polipéptido.

El reconocimiento de linfocitos T está mediado por receptores de linfocitos T (TcR) alfa, beta y gamma con distribución clonotípica que interaccionan con las moléculas cargadas con péptidos del péptido MHC (pMHC) (Davis y Bjorkman, Nature 334 (1988) , 395-402) . Las cadenas específicas de antígeno del TcR no poseen dominios de señalización sino que se acoplan al aparato de señalización multisubunidades conservado CD3 (Call, Cell 111 (2002) , 967-979, Alarcon, Immunol. rev. 191 (2003) , 38-46, Malissen Immunol. rev. 191 (2003) , 7-27) . El mecanismo por el cual la unión al TcR se comunica directamente al aparato de señalización sigue siendo una cuestión fundamental en la biología de los linfocitos T (Alarcon, loc. cit.; Davis, Cell 110 (2002) , 285-287) . Parece evidente que las respuestas de linfocitos T sostenidas implican la participación de un correceptor, la oligomerización del TcR y un ordenamiento de grado superior de complejos de TcR-pMHC en la sinapsis inmunológica (Davis & van der Merwe, Curr. Biol. 11 (2001) , R289-R291, Davis, Nat. Immunol. 4 (2003) , 217-224) . Sin embargo, la señalización de TcR muy temprana se produce en ausencia de estos acontecimientos y puede implicar un cambio conformacional inducido por ligando en CD3 épsilon (Alarcon, loc. cit., Davis (2002) , loc. cit., Gil, J. Biol. Chem. 276 (2001) , 1117411179, Gil, Cell 109 (2002) , 901-912) . Las subunidades épsilon, gamma, delta y zeta del complejo de señalización se asocian entre sí para formar un heterodímero de CD3 épsilon-gamma, un heterodímero de CD3 épsilon-delta y un homodímero de CD3 zeta-zeta (Call, loc. cit.) . Diversos estudios han revelado que las moléculas CD3 son importantes para la expresión correcta en la superficie celular del TcR alfa beta y el desarrollo normal de los linfocitos T (Berkhout, J. Biol. Chem. 263 (1988) , 8528-8536, Wang, J. Exp. Med. 188 (1998) , 1375-1380, Kappes, Curr. Opin. Immunol. 7 (1995) , 441-447) . La resolución de la estructura de los fragmentos del ectodominio del heterodímero de CD3 épsilon gamma de ratón mostró que ambas subunidades épsilon gamma son dominios Ig de tipo C2 que interactúan entre sí para formar una configuración yuxtapuesta inusual del dímero (Sun, Cell 105 (2001) , 913-923) . Aunque parece que el tallo rico en cisteína desempeña un papel importante en el control de la dimerización de CD3 (Su, loc. cit., Borroto, J. Biol. Chem. 273 (1998) , 12807-12816) , la interacción por medio de los dominios extracelulares de CD3 épsilon y CD3 gamma es suficiente para el ensamblaje de estas proteínas con el TcR beta (Manolios, Eur. J. Immunol. 24 (1994) , 84-92, Manolios y Li, Immunol. Cell Biol. 73 (1995) , 532-536) . Aunque todavía es controvertido, lo más probable es que la estequiometría dominante del TcR comprenda un TcR alfa beta, un heterodímero de CD3 épsilon gamma, un heterodímero de CD3 épsilon delta y un homodímero de CD3 zeta zeta (Call, loc. cit.) . Dado el papel clave del heterodímero de CD3 épsilon gamma humana en la respuesta inmunitaria, se ha dilucidado recientemente la estructura cristalina de este complejo unido al anticuerpo terapéutico OKT3 (Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004) , 7675-7680) .

Varias estrategias terapéuticas modulan la inmunidad de linfocitos T dirigiéndose a la señalización de TcR, en particular, los anticuerpos monoclonales (Acm) anti-CD3 humana que se usan ampliamente en el ámbito clínico en regímenes inmunosupresores. El Acm de ratón específico frente a CD3 OKT3 fue el primer Acm autorizado para su uso en seres humanos (Sgro, Toxicology 105 (1995) , 23-29) y se usa ampliamente en el ámbito clínico como agente inmunosupresor en trasplantes (Chatenoud, Clin. Transplant 7 (1993) , 422-430, Chatenoud, Nat. Rev. Immunol. 3 (2003) , 123-132, Kumar, Transplant. Proc. 30 (1998) , 1351-1352) , diabetes de tipo 1 (Chatenoud (2003) , loc. cit) y psoriasis (Utset, J. Rheumatol. 29 (2002) , 1907-1913) . Además, los Acm anti-CD3 pueden inducir señalización de linfocitos T parcial y anergia clonal (Smith, J. Exp. Med. 185 (1997) , 1413-1422) . En la literatura se ha descrito el OKT3 como un potente mitógeno de linfocitos T (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980) , 2708-18) y como un potente destructor de linfocitos T (Wong, Transplantation 50 (1990) , 683-9) . El OKT3 presenta estas dos actividades de manera dependiente del tiempo; después de la activación temprana de linfocitos T que da lugar a la liberación citocinas, tras la administración adicional, el OKT3 bloquea posteriormente todas las funciones de linfocitos T conocidas. Es debido a este bloqueo posterior de la función de linfocitos T por lo que el OKT3 ha encontrado una aplicación tan amplia como inmunosupresor en regímenes terapéuticos para la reducción o incluso la eliminación del rechazo tisular de aloinjertos.

Lo más probable es que el OKT3 revierta el rechazo tisular de aloinjertos mediante el bloqueo de la función de todos los linfocitos T, que desempeñan un papel principal en el rechazo agudo. El OKT3 reacciona con y bloquea la función del complejo CD3 de la membrana de linfocitos T humanos, que se asocia con la estructura de reconocimiento de antígenos de los linfocitos T (TCR) y es esencial para la transducción de señales. A qué subunidad del TCR/CD3 se une el OKT3 ha sido objeto de múltiples estudios. Aunque algunas pruebas han apuntado a una especificidad del OKT3 por la subunidad épsilon del complejo de TCR/CD3 (Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989) , 546-50; Kjer-Nielsen, PNAS 101, (2004) , 7675-7680) . Pruebas adicionales han mostrado que la unión del OKT3 al complejo de TCR/CD3 requiere que estén presentes otras subunidades de este complejo (Salmeron, J. Immunol. 147 (1991) , 3047-52) .

Otros anticuerpos bien conocidos específicos para la molécula CD3 se enumeran en Tunnacliffe, Int. Immunol. 1 (1989) , 546-50. Como se indica anteriormente, tales anticuerpos específicos frente a CD3 pueden inducir diversas respuestas de linfocitos T tales como producción de linfocinas (Von Wussow, J. Immunol. 127 (1981) , 1197; Palacious, J. Immunol. 128 (1982) , 337) , proliferación (Van Wauve, J. Immunol. 124 (1980) , 2708-18) e inducción de linfocitos T supresores (Kunicka, en "Lymphocyte Typing II" 1 (1986) , 223) . Esto es, en función de las condiciones experimentales, el anticuerpo monoclonal específico frente a CD3 puede inhibir o inducir citotoxicidad (Leewenberg,

J. Immunol. 134 (1985) , 3770; Phillips, J. Immunol. 136 (1986) 1579; Platsoucas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) , 4500; Itoh, Cell. Immunol. 108 (1987) , 283-96; Mentzer, J. Immunol. 135 (1985) , 34; Landegren, J. Exp. Med. 155 (1982) , 1579; Choi (2001) , Eur. J. Immunol. 31, 94-106; Xu (2000) , Cell Immunol. 200, 16-26; Kimball (1995) , Transpl. Immunol. 3, 212-221) .

El documento WO 2007/033230 divulga anticuerpos frente a la secuencia EMGGITQTPYKVSISGT de CD3 que corresponde a los residuos 6-22 de la CD3épsilon humana.

Aunque se ha informado de que muchos de los anticuerpos frente a CD3 descritos en la técnica reconocen la subunidad CD3 épsilon del complejo CD3, la mayoría de ellos se unen en realidad a epítopos conformacionales y, por tanto, sólo reconocen la CD3 épsilon en el contexto nativo del TCR. Los epítopos conformacionales se caracterizan por la presencia de dos o más residuos de aminoácido distintos que están separados en la secuencia primaria, pero se juntan sobre la superficie de la molécula cuando el polipéptido se pliega en la proteína/antígeno nativo (Sela, (1969) Science 166, 1365 y Laver, (1990) Cell 61, 553-6) . Los epítopos conformacionales unidos a anticuerpos frente a CD3 épsilon descritos en la técnica pueden separarse en dos grupos. En el grupo principal, dichos epítopos están formados por dos subunidades CD3, p. ej., por la cadena CD3 épsilon y la cadena CD3 gamma o CD3 delta. Por ejemplo, se ha descubierto en varios estudios que... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que comprende un primer dominio de unión que es un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de la cadena CD3ε humana y de Callithrix jacchus, Saguinus oedipus o Saimiri sciureus, en la que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 u 8 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu, y un segundo dominio de unión capaz de unirse a EGFR, Her2/neu o IgE de un ser humano y/o de un primate distinto de chimpancé.

2. El polipéptido como se define en la reivindicación 1, en el que el epítopo forma parte de una secuencia de aminoácidos comprendida en el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8 y comprende al menos la secuencia de aminoácidos Gln-Asp-Gly-Asn-Glu.

3. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el primer dominio de unión comprende una región VL que comprende CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 seleccionadas de:

(a) CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 27, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 28 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 29;

(b) CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 117, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 118 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 119; y

(c) CDR-L1 como se representa en la SEQ ID NO: 153, CDR-L2 como se representa en la SEQ ID NO: 154 y CDR-L3 como se representa en la SEQ ID NO: 155.

4. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el primer dominio de unión comprende una región VH que comprende CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 seleccionadas de:

(a) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 12, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 13 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 14;

(b) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 30, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 31 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 32;

(c) (c) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 48, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 49 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 50;

(d) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 66, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 67 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 68;

(e) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 84, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 85 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 86;

(f) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 102, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 103 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 104;

(g) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 120, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 121 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 122;

(h) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 138, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 139 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 140;

(i) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 156, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 157 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 158; y

(j) CDR-H1 como se representa en la SEQ ID NO: 174, CDR-H2 como se representa en la SEQ ID NO: 175 y CDR-H3 como se representa en la SEQ ID NO: 176.

5. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el primer dominio de unión comprende una región VL seleccionada del grupo que consiste en una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 o 165.

6. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el primer dominio de unión comprende una región VH seleccionada del grupo que consiste en una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 o 181.

7. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el primer dominio de unión comprende una región VL y una región VH seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 17 o 21 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 15 o 19;

(b) una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 35 o 39 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 33 o 37;

(c) una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 53 o 57 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 51 o 55;

(d) una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 71 o 75 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 69 o 73;

(e) una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 89 o 93 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 87 o 91;

(f) una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 107 o 111 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 105 o 109;

(g) una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 125 o 129 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 123 o 127;

(h) una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 143 o 147 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 141 o 145;

(i) una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 161 o 165 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 159 o 163; y

(j) una región VL como se representa en las SEQ ID NO: 179 o 183 y una región VH como se representa en las SEQ ID NO: 177 o 181.

8. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el primer dominio de unión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 o 187.

9. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho polipéptido es una molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico.

10. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico comprende un grupo de las secuencias siguientes como CDR H1, CDR H2, CDR H3, CDR L1, CDR L2 y CDR L3 en el segundo dominio de unión seleccionadas de las SEQ ID NO: 441 -446, las SEQ ID NO: 453 -458, las SEQ ID NO: 463 -468, las SEQ ID NO: 481 -486.

11. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la molécula de anticuerpo monocatenario biespecífico comprende una secuencia seleccionada de:

(a) una secuencia de aminoácidos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 389, 391, 393, 395, 397, 399, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 447, 449, 451, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 495, 497, 499, 501, 503 y 505; y

(b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácidos nucleicos como se representa en cualquiera de las SEQ ID NO: 390, 392, 394, 396, 398, 400, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 448, 450, 452, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 496, 498, 500, 502, 504 y 506.

12. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un vector, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos como se define en la reivindicación 12.

14. Una célula huésped transformada o transfectada con un vector como se define en la reivindicación 13.

15. Un procedimiento para la producción de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, comprendiendo dicho procedimiento cultivar una célula huésped como se define en la reivindicación 14 bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y recuperar el polipéptido producido del cultivo.

16. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o producido de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 15.

17. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o producido de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 15 para su uso en la prevención, el tratamiento o la mejora de una enfermedad seleccionada de entre una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral o un trastorno inmunológico.

18. Un kit que comprende un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, una molécula

de ácido nucleico como se define en la reivindicación 12, un vector como se define en la reivindicación 13 o una célula huésped como se define en la reivindicación 14.

Figura 1

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199 200 201 202 203 204

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