ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad exonucleasa 3'' a 5'' atenuada.

AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada que comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5'derivada de una eubacteria termofílica del género Thermotoga,

en la que dicho dominio de exonucleasa 3' a 5'comprende un motivo de secuencia que presenta la fórmula X5X6X7XSX9XlOX11X12X13X14 (SEC ID nº 1), en la que:X5 es un residuo alanina, X6 es un residuo alanina o un residuo asparagina, X7 es un residuo leucina, Xs es unresiduo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo aspartato, X11 es un residuo tirosina, X12 es un residuolisina, X13 es un residuo valina y X14 es un residuo leucina, en la que dicha AON polimerasa muestra una actividad deexonucleasa 3' a 5' atenuada, de aproximadamente 6,5 ó inferior, aunque superior a O U/pmol, en la que una unidadde actividad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadena sencilla deSEC ID nº 80 u oligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, midiendo las actividades enzimáticasutilizando el ensayo estándar de actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido decadena sencilla marcado en el extremo 5' y/o en el que dicha AON polimerasa presenta una actividad de polimerasa5' a 3' y una actividad de exonucleasas 3' a 5' atenuada, en la que la proporcion de dicha actividad de polimerasa 5'a 3' en U/pmol a dicha actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol es de entre aproximadamente 100 Y 1, en la queuna unidad de actividad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadenasencilla de SEC ID nº 80 u oligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, y una unidad de actividad depolimerasa 5' a 3' es la cantidad de actividad enzimática necesaria para incorporar 10 nmoles de dNMP en productode AON precipitable con TCA en 30 minutos a 74ºC, midiendo las actividades enzimáticas utilizando el ensayoestándar para la actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido de cadena sencillamarcado en el extremo 5' y las condiciones indicadas en el Ejemplo 3 para la actividad de polimerasa 5' a 3', y/o enla que dicha AON polimerasa presenta aproximadamente 0,1% a 65% de la actividad de la exonucleasa 3' a 5' de laAON polimerasa termoestable o termoactiva no modificada correspondiente, en la que una unidad de exonucleasa 3'a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadena sencilla de SEC ID nº 80 enoligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, midiendo las actividades enzimáticas utilizando el ensayoestándar para la actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido de cadena sencillamarcado en el extremo 5'.

ADN polimerasa termoestable o termoactiva con actividad exonucleasa 3' a 5' atenuada

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a ADN polimerasas termoestables o termoactivas con actividad exonucleasa 3' a 5' ("correctora de errores") atenuada, a métodos de síntesis de las mismas, a métodos para la utilización de las mismas y a kits que comprenden las mismas. Los enzimas resultan útiles en muchas técnicas de ADN recombinante, especialmente en la amplificación de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

Las ADN polimerasas sintetizan moléculas de ADN en la dirección 5' a 3' a partir de desoxinucleósidos trifosfato (nucleótidos) utilizando una cadena molde de ADN complementaria y un cebador mediante la adición sucesiva de nucleótidos al grupo 3'-hidroxilo libre de la cadena en crecimiento. La cadena molde determina el orden de adición de los nucleótidos según apareamiento de bases de Watson-Crick. En las células, las ADN polimerasas participan en la reparación, síntesis y replicación del ADN. Ver, por ejemplo, Kornberg et al., DNA Synthesis, W.H. Freeman, New York, 1992; Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 3a edición, Garland Press, New York, 1994.

Muchas técnicas y protocolos moleculares de clonación implican la síntesis de ADN en reacciones in vitro catalizadas por ADN polimerasas. Por ejemplo, las ADN polimerasas se utilizan en reacciones de marcaje del ADN y de secuenciación del ADN, utilizando nucleótidos marcados con 35S, 32p, 33p o fluorescentemente. Unas de las técnicas de síntesis de ADN más versátiles y más ampliamente utilizadas, la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , se da a conocer en las patentes US nº 4.683.202, nº 4.683.195, nº 4.800.159 y nº 4.965.188 y se comenta en PCR Strategies, Innis et al. (editores) , Academic Press, Inc., 1995.

La ADN polimerasa mejor caracterizada es la ADN polimerasa I de Escherichia coli (Eco Poi 1) . La Eco Poi I y varias ADN polimerasas homólogas a la misma presentan tres funciones enzimáticas: i) una actividad exonucleasa 5' a 3', ii) una actividad exonucleasa 3' a 5', e iii) una actividad de síntesis de ADN. Las dos últimas funciones se sitúan hacia el extremo carboxi-terminal de la proteína, dentro de un fragmento "Klenow" (EcoPol I K) . Pueden tratarse preparaciones enzimáticas de EcoPol I con subtilisina para rendir un Eco Poi I K sin la actividad de exonucleasas 5' a 3'. Ver Brown et al., J. Biol. Chem. 257: 1965-72, 1982; Joyce et al., J. Biol. Chem. 257: 1958-64; Joyce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1830-34, 1983; Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65: 168-75, 1970; Kornberg, 1974; Setlow P. et al., J. Biol. Chem. 247: 224-31, 1972; Setlow et al., J. Biol. Chem. 247: 232-40, 1972; Steitz et al., en: Protein Engineering, capítulo 20, páginas 227 a 35, 1987; Oxender et al. (editores) , Alan R. Liss, New York.

El análisis de la estructura cristalina de EcoPol I K ha demostrado que su cadena peptídica se encuentra plegada en dos dominios diferentes, siendo el dominio más pequeño, de 200 residuos aminoácidos, el dominio de exonucleasa 3' a 5', y el otro dominio, de 400 residuos aminoácidos, el dominio de síntesis de ADN.Ver Ollis et al., Nature 313:762-66, 1985. Los sitios activos de las actividades de exonucleasa 3' a 5' y de síntesis del ADN se encuentran separados por aproximadamente 30 angstroms. Ver id. El sitio activo de síntesis de ADN se une al ADN de doble cadena que contiene una extensión 5' de cadena sencilla y desoxinucleósido trifosfato (dNTP) , mientras que el sitio activo de exonucleasa 3' a 5' se une a ADN de cadena sencilla y a desoxinucleósido monofosfato (dNMP) . Ver id. La existencia de un sitio activo de exonucleasa 3' a 5' conservado presente en varias ADN polimerasas fue predicho por Bernat et al., Cell 59: 219-28, 1989; Blanco et al., Gene 112: 139-44, 1992; Reha-Krantz, Gene 112: 133-37, 1992.

El dominio de síntesis de ADN de EcoPol I ha sido clonado, expresado y caracterizado independientemente de los dominios de exonucleasa 3' a 5' y 5' a 3'. Tal como se ha comentado anteriormente, el dominio de síntesis de ADN contiene aproximadamente 400 aminoácidos. La actividad de polimerasa en el dominio de síntesis de ADN es 50 veces inferior a la de EcoPol I K. Ver Derbyshire et al., Nucleic Acids Res. 21 :5439-48, 1993.

Las ADN polimerasas termoestables y termoactivas derivadas de una diversidad de organismos han sido descritas ampliamente en la literatura. Entre los ejemplos particulares se incluyen ADN polimerasas de una diversidad de especies del género de eubacteria Thermus; ver la patente US nº 5.466.591, en particular de Thermus aquaticus (ADN polimerasa Taq) , descrita en las patentes US nº 4.889.818, nº 5.352.600 y nº 5.079.352, y la ADN polimerasa de la especie de eubacteria Thermotoga maritima (ADN polimerasa Tma) , descrita en las patentes US nº 5.374.553 y nº 5.420.029.

Tanto E. coli, un mesófilo, como T. maritima, un termófilo, son eubacterias. Al igual que la ADN polimerasa I de E. coli, la ADN polimerasa Tma presenta tanto una actividad de exonucleasa 5' a 3' como una actividad de exonucleasa 3' a 5'. En contraste, las ADN polimerasas de las especies de Thermus, que también son eubacterias termofílicas, presentan únicamente actividad de exonucleasa 5' a 3'. Puede encontrarse una revisión de las ADN polimerasas termoestables y termoactivas, y sus actividades asociadas, en Abramson, 1995, en: PCR Strategies, Innis et al. (editores) , Academic Press, Inc. Las formas mutantes de varias ADN polimerasas de arqueobacterias y eubacterias termoestables o termoactivas que no presentan una actividad de exonucleasa 3' a 5' se describen en las patentes US nº 6.015.668, nº 5.939.301, nº 5.988.614, nº 5.882.904 y nº 5.489.523.

Aunque EcoPol I y la ADN polimerasa Tma presentan las mismas tres actividades enzimáticas y la misma estructura general del dominio, son enzimas muy diferentes. Por ejemplo, EcoPol I y la ADN polimerasa Tma presentan secuencias de aminoácidos muy diferentes. En particular, incluso tras la introducción de huecos en sus secuencias para optimizar su alineación, los dominios de exonucleasa 3' a 5' de dichas dos proteínas sólo son idénticas aproximadamente al 33%. Además, los dos enzimas muestran diferentes actividades específicas y diferente resistencia a las condiciones de desnaturalización química. Debido a que dichas diferencias se observan en enzimas purificados que han sido apartados de sus ambientes in vivo naturales, deben responder a diferencias en las secuencias de aminoácidos de los enzimas mismos.

La actividad de exonucleasa 3' a 5' "corrige" la cadena naciente de ADN a medida que se va sintetizando y preferentemente elimina nucleótidos de la misma que no se aparean correctamente con la cadena molde, incrementando de esta manera la fidelidad de la síntesis del ADN. Sin embargo, la presencia de una actividad de exonucleasa 3' a 5' robusta puede resultar problemática para las reacciones de polimerización in vitro, en particular la PCR, en la que la presencia de una actividad de exonucleasa 3' a 5' reduce la eficiencia de la amplificación. Ver Barnes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :2216-20, 1994.

Se han realizado esfuerzos para evitar los efectos deletéreos de la actividad de exonucleasa 3' a 5' mediante la utilización de un enzima de ADN polimerasa que no presenta una actividad de exonucleasa 3' a 5'. La polimerasa Taq no presenta naturalmente dicha actividad. Otras ADN polimerasas han sido manipuladas genéticamente para eliminarla. Ver, por ejemplo, las patentes US nº 6.015.668, nº 5.939.301, nº 5.988.614, nº 5.882.904 y nº 5.489.523. La patente US nº 6.228.628 da a conocer determinados residuos aminoácidos en la ADN polimerasa Tma considerados críticos para la actividad de exonucleasa 3' a 5', en la que en particular las mutaciones D323A y E325A se ha demostrado que esencialmente eliminan la actividad de exonucleasa 3' a 5'. Dichos enzimas funcionan en aplicaciones en las que resulta innecesaria una mayor fidelidad de la replicación, por ejemplo en una PCR utilizada para amplificar un molde para reacciones de secuenciación del ADN, análisis de tamaños, análisis de enzimas de restricción o análisis basados en sondas.

Sin embargo, otras reacciones de polimerización, por ejemplo PCR para amplificar un fragmento de ADN para la clonación, requieren un nivel de fidelidad más alto. En un esfuerzo para reducir los problemas asociados a la actividad de exonucleasa 3' a 5', conservando... [Seguir leyendo]

1. AON polimerasa termoestable o termoactiva aislada que comprende un dominio de exonucleasa 3' a 5' derivada de una eubacteria termofílica del género Thermotoga, en la que dicho dominio de exonucleasa 3' a 5' comprende un motivo de secuencia que presenta la fórmula X5X6X7XSX9XlOX11X12X13X14 (SEC ID nº 1) , en la que: X5 es un residuo alanina, X6 es un residuo alanina o un residuo asparagina, X7 es un residuo leucina, Xs es un residuo lisina, Xg es un residuo fenilalanina, XlO es un residuo aspartato, X11 es un residuo tirosina, X12 es un residuo lisina, X13 es un residuo valina y X14 es un residuo leucina, en la que dicha AON polimerasa muestra una actividad de exonucleasa 3' a 5' atenuada, de aproximadamente 6, 5 ó inferior, aunque superior a OU/pmol, en la que una unidad de actividad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadena sencilla de SEC ID nº 80 u oligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, midiendo las actividades enzimáticas utilizando el ensayo estándar de actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido de cadena sencilla marcado en el extremo 5' y/o en el que dicha AON polimerasa presenta una actividad de polimerasa 5' a 3' y una actividad de exonucleasas 3' a 5' atenuada, en la que la proporcion de dicha actividad de polimerasa 5' a 3' en U/pmol a dicha actividad de exonucleasa 3' a 5' en U/pmol es de entre aproximadamente 100 Y 1, en la que una unidad de actividad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadena sencilla de SEC ID nº 80 u oligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, y una unidad de actividad de polimerasa 5' a 3' es la cantidad de actividad enzimática necesaria para incorporar 10 nmoles de dNMP en producto de AON precipitable con TCA en 30 minutos a 74ºC, midiendo las actividades enzimáticas utilizando el ensayo estándar para la actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido de cadena sencilla marcado en el extremo 5' y las condiciones indicadas en el Ejemplo 3 para la actividad de polimerasa 5' a 3', y/o en la que dicha AON polimerasa presenta aproximadamente 0, 1% a 65% de la actividad de la exonucleasa 3' a 5' de la AON polimerasa termoestable o termoactiva no modificada correspondiente, en la que una unidad de exonucleasa 3' a 5' cataliza la conversión de 50 pmoles de un oligonucleótido de cadena sencilla de SEC ID nº 80 en oligonucleótidos de menor longitud, en 15 minutos a 63ºC, midiendo las actividades enzimáticas utilizando el ensayo estándar para la actividad de exonucleasa 3' a 5', que mide la degradación de un oligonucleótido de cadena sencilla marcado en el extremo 5'.