ADENOVIRUS RECOMBINANTE DEL SEROTIPO AD11.

La presente invención se refiere al campo de la terapia génica, en particular a la terapia génica que implica elementos derivados de virus, más concretamente elementos de adenovirus. Los adenovirus han sido propuestos como vehículos adecuados para liberar genes al anfitrión. Existen numerosos rasgos de los adenovirus que los hacen particularmente útiles para el desarrollo de vectores de transferencia génica para la terapia génica en humanos: El genoma de adenovirus está bien caracterizado. Consta de una molécula de ADN de doble hebra lineal de aproximadamente 36.000 pares de bases. El ADN de adenovirus contiene Repeticiones Terminales Invertidas (ITR) idénticas de aproximadamente 90-140 pares de bases con una longitud exacta que depende del serotipo. Los orígenes de replicación virales están en las ITR exactamente en los extremos del genoma; La biología de los adenovirus está caracterizada en detalle; el adenovirus no está asociado con una patología humana grave en individuos inmunocompetentes; El virus es extremadamente eficaz al introducir su ADN en la célula anfitriona; el virus puede infectar una amplia gama de células y tiene una amplia gama de anfitriones; El virus puede ser producido a elevados títulos de virus en grandes cantidades; El virus se puede volver de replicación defectuosa mediante la deleción de la región temprana 1 (E1) del genoma viral (Brody et al., 1994). La mayoría de los vectores adenovirales utilizados en la actualidad en la terapia génica tienen una deleción en la región E1, en la que se puede introducir la información genética deseada. Basándose en estas características, los métodos preferidos para la transferencia génica in vivo en células diana humanas, hacen uso de vectores adenovirales como vehículos de liberación de genes. No obstante, todavía existen desventajas asociadas con el uso terapéutico de vectores adenovirales en humanos. Una desventaja principal es la existencia de una inmunidad pre-existente muy difundida entre la población contra los adenovirus. La exposición a adenovirus de tipo salvaje es muy común en humanos, como ya se ha documentado ampliamente [revisado en Wadell, 1984]. Esta exposición ha dado como resultado respuestas inmunitarias contra la mayor parte de los tipos de adenovirus, no sólo contra los adenovirus a los cuales han sido expuestos los individuos realmente, si no también contra los adenovirus que tienen epítopos similares (neutralizantes). Este fenómeno de los anticuerpos pre-existentes en humanos, combinado con una fuerte respuesta inmunitaria humoral y celular secundaria contra el virus, puede afectar seriamente a la transferencia génica utilizando vectores adenovirales recombinantes. Hasta la fecha, se han propuesto seis subgrupos diferentes de adenovirus humanos que en total abarcan 51 serotipos de adenovirus distintos (véase el la Tabla 1). Un serotipo se define basándose en su carácter distintivo determinado por neutralización cuantitativa con antisueros animales (caballo, conejo). Si la neutralización muestra cierto grado de reacción cruzada entre dos virus, se supone el carácter distintivo del serotipo si A) las hemaglutininas no están relacionadas, como muestra la carencia de reacción cruzada en la inhibición de hemaglutinación, o B) existen diferencias biofísicas/bioquímicas sustanciales en el ADN (Francki et al., 1991). Los nueve serotipos identificados finalmente (42-51) fueron aislados por primera vez de pacientes infectados con VIH (Hierholzer et al. 1988; Schnurr et al., 1993). Por razones no bien comprendidas, la mayoría de los pacientes inmunocomprometidos desprendían adenovirus raramente o jamás aislados de individuos inmunocompetentes (Hierholzer et al., 1988, 1992; Khoo et al., 1995, De Jong et al., 1998). La inmensa mayoría de los individuos habían sido expuestos previamente a adenovirus, especialmente los serotipos de adenovirus 5 y el tipo 2 (Ad5 y Ad2) bien investigados o a serotipos inmunológicamente relacionados. Importantemente, estos dos serotipos también son los más ampliamente estudiados para su uso en terapia génica en humanos. El adenovirus recombinante según la invención también puede comprender elementos de otros (adeno)virus, con tal que se remplace un elemento que pudiera conducir a la inmunidad contra semejante vehículo de reparto génico por un elemento de adenovirus 35 o un homólogo funcional del mismo, que tenga reducida semejante desventaja y preferiblemente que evite semejante desventaja. En la presente invención un vehículo de reparto génico es cualquier vehículo que sea capaz de liberar un ácido nucleico de interés en una célula anfitriona. Este debe, según la invención comprender un elemento de adenovirus 35 o un equivalente funcional de semejante elemento, que debe tener un efecto beneficioso en lo referente a la respuesta inmunitaria contra semejante vehículo. Básicamente todos los demás elementos que constituyen el vehículo pueden ser cualquiera de los elementos conocidos en la técnica o desarrollados en la técnica, con tal que juntos sean capaces liberar dicho ácido nucleico de interés. En principio el experto en la técnica puede utilizar y/o producir cualquiera de los productos adenovirales o sistemas de producción que puedan o hayan sido aplicados en el campo de los adenovirus. Típicamente los productos de la invención pueden ser elaborados en células de empaquetamiento utilizables v.g. para adenovirus 5, típicamente los vectores basados en adenovirus 35 pueden ser producidos y/o utilizados de la misma manera que los de los otros adenovirus 2   v.g. adenovirus 2 y/o 5. Una buena visión de conjunto de las posibilidades de los vectores mínimos, los sistemas de empaquetamiento, la amplificación intracelular, los sistemas basados en vectores y plásmidos puede ser encontrada en las solicitudes copendientes de los autores de la presente solicitud (PCT/NL99/00235 y PCT/NL96/00244). Los sistemas de liberación no virales también pueden ser proporcionados con elementos según la invención como lo pueden los sistemas de liberación virales. Ambas clases de sistemas son bien conocidas en la técnica en muchas estructuras diferentes y por lo tanto no necesitan ninguna explicación adicional aquí. Una revisión de los muchos sistemas diferentes y de sus propiedades se puede encontrar en Robbins y Ghivizzani (1998) y en Prince (1998). Los vehículos de liberación génica contienen típicamente un ácido nucleico de interés. Un ácido nucleico de interés puede ser un gen o una porción funcional de un gen (donde un gen es cualquier ácido nucleico que puede ser expresado) o un precursor de un gen o un gen transcrito en cualquier nivel de ácido nucleico (ADN y/o ARN; de hebra doble o sencilla). Los genes de interés son bien conocidos en la técnica e incluyen típicamente aquellos que codifican proteínas terapéuticas tales como TPA, EPO, citocinas, anticuerpos o derivados de los mismos, etc. Una visión de conjunto de las proteínas terapéuticas que se van a aplicar en terapia génica se enumera más abajo. Factores inmunoestimuladores como los antígenos específicos de tumores, las citocinas, etc.; Ejemplos no limitantes de factores anti-angiogénicos endostatina, angiostatina, ATF-BPTI CDT-6, mutantes VEGF negativos dominantes, etc.; Ejemplos no limitantes de factores angiogénicos VEGF, Factores de crecimiento de fibroblastos, Oxido nítrico sintetasas, Péptidos natriuréticos de tipo C, etc.; Proteínas inhibidoras de la inflamación como CD40 soluble, FasL, IL-12, IL-10, IL-4, IL-13 y anticuerpos de cadena sencilla excretados para CD4, CD5, CD7, CD52, IL-2, IL-1, IL-6, TNF, etc. o anticuerpos de cadena sencilla excretados al receptor de las células T en células T auto-reactivas. También se pueden utilizar mutantes negativos de PML dominantes para inhibir la respuesta inmunitaria. Además, se pueden utilizar antagonistas de las citocinas promotoras de la inflamación, por ejemplo la IL-1RA (antagonista de receptor) y los receptores solubles como sIL-1RI, sIL-1RII, sTNFRI y sTNFRII. Asimismo se pueden utilizar genes inhibidores del crecimiento y/o la respuesta inmunitaria tales como ceNOS, Bc13, cactus e Iß, ß o y las proteínas que inducen la apoptosis como la proteína VP3 del virus de la anemia de pollo. Además, se pueden utilizar genes suicidas como HSV-TK, citosina desaminasa, nitrorreductasa y linamerasa. Un ácido nucleico de interés también puede ser un ácido nucleico que puede hibridar con una secuencia de ácido nucleico presente en la célula anfitriona inhibiendo de ese modo la expresión o transcripción o traducción de dicho ácido nucleico. También puede bloquear por medio de la co-supresión. En resumen un ácido nucleico de interés es cualquier ácido nucleico que se puede desear para proporcionar a una célula con el fin de inducir una respuesta por esa célula, cuya respuesta puede... [Seguir leyendo]

1.Un adenovirus recombinante, que comprende una deleción en la región E1, volviendo dicha deleción a dicho adenovirus incompetente para la replicación donde dicho adenovirus es un adenovirus humano de serotipo 11 (Ad11). 2.Un adenovirus recombinante según la reivindicación 1, donde dicho adenovirus comprende un gen de interés. 3. Un adenovirus recombinante según la reivindicación 2, donde dicho gen de interés es incorporado en la posición de la deleción E1. 4. Un ácido nucleico que codifica un adenovirus recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3. 5. Una célula que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 4. 6. Una célula según la reivindicación 5, que completa los elementos necesarios para la replicación adenoviral que están ausentes del ácido nucleico según la reivindicación 4. 7. Una célula según la reivindicación 6, que se origina a partir de una célula PER.C6 cell (número de consigna ECACC 96022940). 8. Un método para producir un adenovirus recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende expresar un ácido nucleico según la reivindicación 4 en una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, y cosechar el adenovirus recombinante resultante.   81   82   83   84     Figura 6. continuación Figura 6: Secuencia completa de Ad35 86   Figura 6. continuación 87   Figura 6. continuación 88   Figura 6. continuación 89   Figura 6. continuación   Figura 6. continuación 91   92   93   94     96   97   98   99     101   102   103   104     106   107   108   109     111   112   113   114     116   117   118   119     121   122   123