Un promotor que comprende un polinucleótido de SEQ ID NO: 1.

Ícido nucleico promotor obtenido a partir del género Cor y nebacterium, casete de expresión que comprende el promotor y vector, célula hospedadora que comprende el vector, vector y método para expresión de un gen que utiliza la célula.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo ácido nucleico promotor derivado de bacterias del género Cor y nebacterium, una casete de expresión que incluye el mismo, un vector que incluye la casete de expresión, una célula hospedadora que incluye un vector, y un método de expresión de un gen que utiliza la célula hospedadora.

Técnica anterior

Las bacterias corineformes son microorganismos utilizados para producir diversos materiales químicos utilizados en muchas aplicaciones, tales como piensos animales, medicinas, y alimentos que incluyen L-lisina, L-treonina, y diversos ácidos nucleicos. Una cepa de bacterias corineformes que exhibe productividad alta puede desarrollarse por ingeniería genética e ingeniería metabólica. Para obtener una cepa de este tipo de bacterias corineformes que exhiben productividad alta, es necesario expresar en las bacterias corineformes un gen relacionado con diversos caminos metabólicos. A este fin, es preciso desarrollar un promotor adecuado.

Generalmente, en las bacterias corineformes, se expresa un gen bajo un promotor incluido inherentemente en ellas. (Véase, por ejemplo, Journal of Bacteriology, 181 (19) , 6188-6191, 1999) . Entretanto, la estructura de una secuencia promotora para expresión de un gen de bacterias corineformes se desconoce, mientras que las estructuras de otros microorganismos industriales, tales como E. coli y Bacillus subtilis, son conocidas. Por esta razón, se ha sugerido el método siguiente para producir promotores que permitan la expresión de un gen en bacterias corineformes. En primer lugar, se elimina una región promotora de un gen que es resistente a un antibiótico, tal como cloranfenicol. Por separado, se escinde un DNA cromosómico separado de bacterias corineformes utilizando una enzima de restricción adecuada, y el fragmento resultante se introduce en el gen del que se ha eliminado la región promotora. A continuación, se utiliza el gen obtenido para transformar bacterias corineformes a fin de producir una cepa transformada y se mide la resistencia a los antibióticos de la cepa transformada: (véase Gene 102, 93-98, 1991; Microbiology, 142, 1297-1309, 1996.) En particular, se han desarrollado un número muy pequeño de promotores utilizados en Cor y nebacterium ammoniagenes, un microorganismo productor de ácido nucleico conocido. Por ejemplo, se utiliza un promotor que tiene aproximadamente una actividad 10% mayor que un promotor tac en E. coli (véase Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003.) Sin embargo, cuando se utiliza el mismo en una expresión másica de genes, un promotor de este tipo exhibe eficiencia baja. La Patente U.S. No. 5.593.781 describe un DNA promotor que se separa de una cepa de Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) y tiene mayor actividad que un promotor tac. Sin embargo, un DNA promotor de este tipo que está separado de un género de Brevibacterium puede no ser operativo en otras bacterias. Por consiguiente, es necesario desarrollar una secuencia promotora que se derive de Cor y nebacterium ammoniagenes disponible comercialmente, y tenga actividad elevada en otras bacterias.

De acuerdo con lo anterior, los autores de la presente invención buscaron una secuencia promotora fuerte en Cor y nebacterium ammoniagenes y encontraron que un promotor de acuerdo con la presente invención puede expresar genes con actividad elevada en Cor y nebacterium ammoniagenes.

Descripción de los dibujos FIG. 1 muestra los resultados de un ensayo de electroforesis bidimensional de una muestra extraída de una bacteria Cor y nebacterium ammoniagenes, en donde los resultados del ensayo se tiñeron con plata y se revelaron para identificación;

FIG. 2 ilustra un método de producción de un vector de cribado de p117-gfp de acuerdo con una realización de la presente invención; y FIG. 3 ilustra un método de producción de un vector recombinante que incluye la secuencia promotora pcj1 a pcj7 de un vector derivado p117-gfp de acuerdo con una realización de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Problema técnico

La presente invención proporciona un promotor que tiene actividad alta en Cor y nebacterium.

La presente invención proporciona también una casete de expresión que incluye el promotor y un vector que incluye la casete de expresión.

La presente invención proporciona también una célula hospedadora que incluye el vector.

La presente invención proporciona también un método de expresión de un gen que utiliza la célula hospedadora.

Solución técnica

La presente invención proporciona un promotor que comprende un polinucleótido de SEQ ID NO: 1.

El promotor de acuerdo con una realización de la presente invención es un ácido nucleico aislado y tiene actividad promotora. En esta memoria, el término "promotor" hace referencia a una región de DNA a la cual se une una RNApolimerasa para iniciar la transcripción de un gen. El término "promotor tac" se refiere a un promotor obtenido por fusión de una secuencia obtenida a partir de la región -35 de un promotor del operón triptófano de E. coli y una secuencia obtenida a partir de la región -10 de un promotor del operón lactosa de E. coli. Es sabido que el promotor tac tiene una alta actividad promotora. Un promotor que tiene al menos un ácido nucleico seleccionado de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6 y 7 tiene mayor actividad en bacterias del género Cor y nebacterium que el promotor tac. En particular, un promotor que tiene al menos un ácido nucleico seleccionado de SEQ ID NOs: 1 y 4 tiene una actividad 10 veces mayor que el promotor tac en bacterias del género Cor y nebacterium.

El promotor de acuerdo con una realización de la presente invención tiene actividad promotora en bacterias del género Escherichia, adicionalmente a bacterias del género Cor y nebacterium. En particular, el promotor que contiene SEQ ID NO: 1 exhibe una actividad promotora dos veces mayor que el promotor tac incluso en bacterias del género Escherichia.

La célula en la cual puede funcionar el promotor de la presente invención puede ser cualquier bacteria del género Cor y nebacterium. Ejemplos de bacterias del género Cor y nebacterium incluyen Cor y nebacterium ammoniagenes CJHB100 (KCCM-10330) y ATCC 6871, Cor y nebacterium glutamicum ATCC 13032 y ATCC 13060, y análogas. Sin embargo, las bacterias del género Cor y nebacterium no se limitan a las anteriores. Ejemplos de bacterias del género Escherichia en las cuales puede funcionar un promotor de acuerdo con una realización de la presente invención, incluyen E. coli.

La secuencia del promotor de acuerdo con una realización de la presente invención puede ser modificada fácilmente por una persona que tenga experiencia ordinaria en la técnica mediante un proceso de mutagénesis conocido, tal como evolución orientada y mutagénesis orientada. De acuerdo con ello, un ácido nucleico que tiene, por ejemplo, 70% o más de homología, preferiblemente 80% o más de homología, y más preferiblemente, 90% o más de homología, incluyendo la secuencia aislada del promotor al menos un ácido nucleico seleccionado de SEQ ID NO: 1, y puede actuar como un promotor en bacterias del género Cor y nebacterium está incluido en el alcance de la presente invención.

La presente invención proporciona también una casete de expresión que incluye el promotor que está enlazado operativamente a una secuencia codificante. La secuencia codificante puede ser, por ejemplo, el gen entero o una secuencia codificante que codifica una región predeterminada del gen. En esta memoria, el término "enlazado operativamente" indica que la secuencia codificante está conectada funcionalmente al promotor de tal modo que la secuencia promotora puede iniciar o mediar la transcripción de la secuencia codificante. La casete de acuerdo con una realización de la presente invención puede incluir adicionalmente secuencias de control 5<'> y 3<'> enlazadas operativamente a la secuencia promotora. La secuencia codificante puede ser un gen asociado con un producto metabólico, tal como IMP, GMP, L-lisina y L-treonina.

La presente invención proporciona también un vector que incluye la casete de expresión de acuerdo con una realización de la presente invención. En este caso, el vector no... [Seguir leyendo]

1. Un promotor que comprende un polinucleótido de SEQ ID NO: 1.

2. Una casete de expresión, que comprende el promotor de la reivindicación 1 y está enlazada operativamente a una secuencia codificante.

3. Un vector que comprende la casete de expresión de la reivindicación 2.

4. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 3.

5. La célula hospedadora de la reivindicación 4, que es una célula bacteriana perteneciente a un género Cor y nebacterium o un género Escherichia.

6. Un método de expresión de un gen exógeno que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindica10 ción 4 o la reivindicación 5.

PRODUCTO PCR

Gen gfp (680 pb) Gen gfp

DNA ligasa T4