Una molécula de ADN recombinante que comprende, ligadas operativamente en dirección 5' a 3':

(a) una secuencia promotora; (b) una secuencia líder 5' no traducida que comprende la SEQ ID NO:52; (c) una primera secuencia intrónica aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen seleccionado del grupo constituido por un gen de actina de arroz, un gen de sacarosa sintasa de arroz, un gen de fenilalanina-amoniaco liasa de arroz y un gen de proteína de choque térmico de maíz; (d) una secuencia de codificación de ADN y (e) una secuencia terminadora 3' no traducida aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen de la proteína de choque térmico de trigo, un gen de ubiquitina de trigo, un gen de fructosa 1,6-bisfosfatasa de trigo, un gen de glutelina de arroz, un gen de lactato deshidrogenasa de arroz y un gen de beta-tubulina de arroz

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la ingeniería genética de plantas. Más particularmente, hace referencia a sistemas de expresión génica mejorados para plantas transgénicas que usan diferentes combinaciones de elementos genéticos en un módulo de expresión de planta. La presente invención se refiere también a moléculas de ADN recombinantes que contienen una combinación específica de elementos genéticos y a células de planta y a plantas transformadas con las moléculas de ADN.

Antecedentes de la invención

Los recientes avances en la ingeniería genética han proporcionado las herramientas necesarias para transformar plantas para contener genes extraños. Al construir un gen de planta recombinante deseado e introducirlo en células de planta, es ahora posible generar plantas transgénicas que tienen características únicas de importancia agronómica.

Los elementos genéticos consistentes y fiables para uso en la construcción de genes de planta recombinantes son de gran valor en la ingeniería genética de plantas. Muchos de dichos elementos pueden potenciar los niveles de expresión génica de un gen de interés particular. Al hacer esto, estos elementos proporcionan varias ventajas. En primer lugar, al proporcionar niveles de expresión mejorados, las combinaciones óptimas de elementos genéticos pueden dar como resultado un fenotipo más pronunciado. Esto es debido a la relación observada en muchos casos entre el nivel de expresión transgénica en una planta transgénica y el grado en que se altera una característica de planta deseada.

En segundo lugar, los elementos genéticos no traducidos que son capaces de potenciar la expresión pueden minimizar algunas de las etapas limitantes de la velocidad en la producción de plantas transgénicas. Cuanto mayores sean los niveles de expresión alcanzables, menor número de plantas tienen que producirse y cribarse para recuperar aquellas que producen cantidades de una proteína o molécula de ARN diana suficientes para dar como resultado el fenotipo agronómicamente deseado.

Finalmente, la identificación de una variedad de elementos genéticos alternativos proporciona la ventaja añadida de reducir las redundancias de elementos vectoriales. Por tanto, al introducir por ingeniería genética múltiples transgenes independientes en líneas de plantas transgénicas, el uso de elementos vectoriales de expresión alternativos en los diferentes transgenes ayudará a minimizar la inhibición dependiente de homología de la expresión génica.

Sumario de la invención

La invención dada a conocer en la presente memoria proporciona combinaciones novedosas de elementos genéticos para uso en la construcción de moléculas de ADN recombinantes expresables en plantas. Una molécula de ADN recombinante que contiene las combinaciones de elementos genéticos de la presente invención exhibe niveles de expresión mejorados, como se desea para la transformación y regeneración de plantas transgénicas. Los niveles de expresión mejorados alcanzables usando los elementos de esta invención proporcionan numerosas ventajas, tales como una reducción del laborioso proceso de cribado necesario para la producción de plantas transgénicas y de los fenotipos potenciados así producidos. Además, los elementos son alternativas útiles para aumentar las capacidades de apilamiento de genes de las plantas transgénicas al minimizar la repetición de secuencias que se han asociado a la inestabilidad de la expresión transgénica.

Por lo tanto, según un aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende, ligadas operativamente en dirección 5' a 3':

(a) una secuencia promotora;

(b) una secuencia líder 5' no traducida que comprende la SEQ ID NO:52;

(c) una primera secuencia intrónica aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen seleccionado del grupo constituido por un gen de actina de arroz, un gen de sacarosa sintasa de arroz, un gen de fenilalanina-amoniaco liasa de arroz y un gen de proteína de choque térmico de maíz;

(d) una secuencia de codificación de ADN y

(e) una secuencia terminadora 3' no traducida aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen seleccionado del grupo constituido por un gen de la proteína de choque térmico de trigo, un gen de ubiquitina de trigo, un gen de fructosa 1,6-bisfosfatasa de trigo, un gen de glutelina de arroz, un gen de lactato deshidrogenasa de arroz y un gen de beta-tubulina de arroz.

(a) transformar células de plantas monocotiledóneas con una molécula de ADN recombinante como se define anteriormente;

(b) seleccionar las células de planta que se hayan transformado y

(c) regenerar las células de planta seleccionadas, proporcionando una planta diferenciada.

Se proporcionan además por la invención células transformadas tales como células de planta que contienen las moléculas de ADN de la invención y los tejidos, semillas y plantas diferenciadas producidos a partir de las mismas. Finalmente, la invención proporciona plantas que comprenden las células de planta anteriores. Otros objetos, aspectos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes para los especialistas en la materia a la vista de las siguientes descripciones, ejemplos y reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en la presente memoria. La Fig. 1 ilustra el plásmido pMON19469 La Fig. 2 ilustra el plásmido pMON26052 La Fig. 3 ilustra el plásmido pMON26055 La Fig. 4 ilustra el plásmido pMON26054 La Fig. 5 ilustra el plásmido pMON19433 La Fig. 6 ilustra el plásmido pMON32502 La Fig. 7 ilustra el plásmido pMON32506 La Fig. 8 ilustra el plásmido pMON32509 La Fig. 9 ilustra el plásmido pMON32510 La Fig. 10 ilustra el plásmido pMON32513 La Fig. 11 ilustra el plásmido pMON19437 La Fig. 12 ilustra el plásmido pMON32515 La Fig. 13 ilustra el plásmido pMON32516 La Fig. 14 ilustra el plásmido pMON32517 La Fig. 15 ilustra el plásmido pMON33216 La Fig. 16 ilustra el plásmido pMON33210 La Fig. 17 ilustra el plásmido pMON33220 La Fig. 18 ilustra el plásmido pMON33219 La Fig. 19 ilustra el plásmido pMON47901 La Fig. 20 ilustra el plásmido pMON47906 La Fig. 21 ilustra el plásmido pMON47907 La Fig. 22 ilustra el plásmido pMON47915 La Fig. 23 ilustra el plásmido pMON47916 La Fig. 24 ilustra el plásmido pMON47917 La Fig. 25 ilustra el plásmido pMON47919 La Fig. 27 ilustra el plásmido pMON18364

La Fig. 28 ilustra el plásmido pMON19568

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona elementos genéticos para la expresión mejorada de genes de plantas recombinantes que comprenden combinaciones novedosas de intrones y elementos genéticos 5' y 3' no traducidos dados a conocer en la presente memoria. Las secuencias de ADN y procedimientos de la invención permiten la producción de plantas transgénicas que tienen niveles elevados de una molécula de ARN o proteína de interés deseada, facilitando así la introducción de rasgos agronómicamente deseables en plantas por ingeniería genética.

"Gen de planta recombinante” o “molécula de ADN recombinante”, como se usa en el contexto de esta invención, designa una combinación de elementos genéticos que están ligados operativamente de modo que sean capaces de expresión en una célula de planta de una molécula de ARN y/o proteína deseada. Las moléculas de ADN pueden construirse usando técnicas estándares bien conocidas por los especialistas en esta materia.

En general, un gen de planta recombinante comprende, ligadas operativamente de extremo 5' a 3': (1) una región promotora que causa la producción de una molécula de ARN; (2) una secuencia 5' no traducida; (3) una secuencia de codificación de ADN que codifica un ARN y/o proteína deseado y (4) una región 3' no traducida.

La región de un gen designada como “promotora” es responsable de la regulación de la transcripción de ADN en ARN. Los promotores comprenden la secuencia de ADN, encontrada habitualmente en dirección 5' de una secuencia de codificación, que regula la expresión de la secuencia de codificación en dirección 3' controlando la producción... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ADN recombinante que comprende, ligadas operativamente en dirección 5' a 3':

(a) una secuencia promotora;

(b) una secuencia líder 5' no traducida que comprende la SEQ ID NO:52;

(c) una primera secuencia intrónica aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen seleccionado del grupo constituido por un gen de actina de arroz, un gen de sacarosa sintasa de arroz, un gen de fenilalanina-amoniaco liasa de arroz y un gen de proteína de choque térmico de maíz;

(d) una secuencia de codificación de ADN y

(e) una secuencia terminadora 3' no traducida aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen seleccionado del grupo que consiste en un gen de la proteína de choque térmico de trigo, un gen de ubiquitina de trigo, un gen de fructosa 1,6-bisfosfatasa de trigo, un gen de glutelina de arroz, un gen de lactato deshidrogenasa de arroz y un gen de beta-tubulina de arroz.

2. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la primera secuencia intrónica es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de actina de arroz.

3. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la primera secuencia intrónica es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de sacarosa sintasa de arroz.

4. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la primera secuencia intrónica es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de fenilalanina-amoniaco liasa de arroz.

5. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la primera secuencia intrónica es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de amilasa de arroz.

6. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de glutelina de arroz.

7. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de lactato deshidrogenasa de arroz.

8. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de beta-tubulina de arroz.

9. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de proteína de choque térmico de trigo.

10. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de ubiquitina de trigo.

11. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de fructosa 1,6-bisfosfatasa de trigo.

12. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la primera secuencia intrónica es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de actina de arroz y la secuencia terminadora 3' no traducida se aísla a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de proteína de choque térmico de trigo.

13. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la primera secuencia intrónica es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de actina de arroz y la secuencia terminadora 3' no traducida se aísla a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de fructosa 1,6-bisfosfatasa de trigo.

14. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que el promotor es constitutivo, inducible, regulado por el desarrollo, regulado químicamente, potenciado por tejido o específico de tejido.

15. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la secuencia de codificación de ADN está en la orientación codificante.

16. La molécula de ADN de la reivindicación 1, en la que la secuencia de codificación de ADN está en la orientación anticodificante.

17. Una célula transformada que comprende una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1.

18. La célula transformada de la reivindicación 17, en la que la célula es una célula de planta o bacteria.

19. La célula transformada de la reivindicación 17, en la que la célula es una célula de planta.

20. Una planta que comprende la célula de planta de la reivindicación 19.

21. La planta de la reivindicación 20, en la que la planta es una monocotiledónea.

22. La planta de la reivindicación 20, en la que la planta se selecciona de cebada, avena, maíz, arroz, centeno y trigo.

23. La planta de la reivindicación 21, en la que la planta es una planta de trigo.

24. La planta de la reivindicación 21, en la que la planta es una planta de maíz.

25. Un procedimiento para proporcionar una expresión génica potenciada a plantas monocotiledóneas que comprende:

(a) transformar células de plantas monocotiledóneas con una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1;

(b) seleccionar células de planta que se hayan transformado y

(c) regenerar las células de planta seleccionadas, proporcionando una planta diferenciada.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en la que la primera secuencia intrónica es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de actina de arroz.

27. El procedimiento de la reivindicación 25, en la que la primera secuencia intrónica es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de sacarosa sintasa de arroz.

28. El procedimiento de la reivindicación 25, en la que la primera secuencia intrónica es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de fenilalanina-amoniaco liasa de arroz.

29. El procedimiento de la reivindicación 25, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de glutelina de arroz.

30. El procedimiento de la reivindicación 25, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de lactato deshidrogenasa de arroz.

31. El procedimiento de la reivindicación 25, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de beta-tubulina de arroz.

32. El procedimiento de la reivindicación 25, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de proteína de choque térmico de trigo.

33. El procedimiento de la reivindicación 25, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de ubiquitina de trigo.

34. El procedimiento de la reivindicación 25, en la que la secuencia terminadora 3' no traducida es aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de fructosa 1,6-bisfosfatasa de trigo.

35. El procedimiento de la reivindicación 25, en la que la molécula de ADN recombinante comprende una primera secuencia intrónica aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de actina de arroz y una secuencia terminadora 3' no traducida aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de proteína de choque térmico de trigo.

36. El procedimiento de la reivindicación 25, en la que la molécula de ADN recombinante comprende una primera secuencia intrónica aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de actina de arroz y una secuencia terminadora 3' no traducida aislada a partir de una secuencia nucleotídica asociada a un gen de fructosa 1,6-bisfosfatasa de trigo.

37. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que la molécula de ADN recombinante comprende una primera secuencia intrónica que comprende la SEQ ID NO:50 y una secuencia terminadora 3' no traducida que comprende la SEQ ID NO:58.

38. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que la molécula de ADN recombinante comprende una primera secuencia intrónica que comprende la SEQ ID NO:50 y una secuencia terminadora 3' no traducida que comprende la SEQ ID NO:60.

39. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la secuencia de codificación del ADN está en la orientación codificante.

40. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la secuencia de codificación del ADN está en la orientación anticodificante.

41. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que el promotor es constitutivo, inducible, regulado por el desarrollo, regulado químicamente, potenciado por tejido o específico de tejido.