Una secuencia de nucleótidos ligada en forma operable a un promotor heterólogo,

en la que la secuencia de nucleótido codifica para RT optimizada, Nef truncada, p17 Gag optimizada por codón y p24 Gag optimizada por codón, en el orden RT, Nef, p17 Gag, p24 Gag

Campo de la invención

La presente invención se refiere a construcciones de ácido nucleico, a células huésped que comprenden dichas construcciones y a su uso en vacunas de ácido nucleico. La invención también se refiere a formulaciones de vacuna que comprenden dichas construcciones y al uso de dichas formulaciones en medicina. En particular, la invención se refiere a vacunas de ADN que son útiles en la profilaxis y tratamiento de infecciones por VIH, más particularmente cuando se administran mediante liberación mediada por partícula.

Antecedentes de la invención

El VIH-1 es la causa principal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), que se considera uno de los mayores problemas de salud en todo el mundo. Aunque se han realizado exhaustivas y extensas investigaciones en todo el mundo para producir una vacuna, hasta ahora dichos esfuerzos no han tenido éxito.

Se han descrito proteínas que no pertenecen a la cubierta del VIH-1 e incluyen, por ejemplo, proteínas de la estructura interna, tales como los productos de los genes gag y pol y otras proteínas estructurales tales como Rev, Nef, Vif y Tat (Green y col., New England J. Med, 324, 5, 308 y sig. (1991) y Bryant y col. (Ed. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 y sig. (1992)).

El gen gag se traduce a partir del ARN de longitud completa para dar una poliproteína precursora que después se fragmenta en 3-5 proteínas de la cápside; la proteína de la matriz, la proteína de la cápside y la proteína de unión a ácido nucleico y proteasa. (1. Fundamental Virology, Fields BN, Knipe DM and Howley M 1996 2. Fields Virology vol 2 1996).

El gen gag da lugar a la proteína precursora Gag de 55 kilodalton (kDa), también denominada p55, que se expresa a partir del ARNm viral sin ayustar. Durante la traducción, el extremo N-terminal de p55 se miristoíla, desencadenando su asociación con el lado citoplásmico de las membranas celulares. La poliproteína Gag asociada con la membrana recluta dos copias del ARN genómico viral junto con otras proteínas virales y celulares que desencadenan la gemación de la partícula viral a partir de la superficie de una célula infectada. Tras la gemación, la p55 es fragmentada por la proteasa codificada por el virus (un producto del gen pol) durante el proceso de la maduración viral en cuatro proteínas más pequeñas denominadas MA (matriz [p17]), CA (cápside [p24]), NC (nucleocápside [p9]) y p6. (4)

Además de las 3 proteínas Gag principales, todos los precursores de Gag contienen otras varias regiones que se fragmentan y permanecen en el virión como péptidos de varios tamaños. Estas proteínas tienen diferentes funciones, por ejemplo la proteína p2 tiene un papel propuesto en la regulación de la actividad de la proteasa y contribuye a la correcta cronología del procesamiento proteolítico.

El polipéptido MA deriva del extremo miristolado en N terminal de p55. La mayoría de las moléculas de MA permanecen unidas a la superficie interna de la bicapa lipídica del virión, estabilizando la partícula. Una subpoblación de MA es reclutada en el interior de las capas más profundas del virión, donde pasa a formar parte del complejo que escolta al ADN viral al núcleo. (5) Estas moléculas de MA facilitan el transporte nuclear del genoma viral porque la maquinaria de importación nuclear de la célula reconoce una señal cariofílica en MA. Este fenómeno permite que el VIH infecte las células que no están en división, una propiedad inusual para un retrovirus.

La proteína p24 (CA) forma el núcleo cónico de las partículas víricas. Se ha demostrado con la ciclofilina A interacciona con la región p24 de p55, lo que conduce a su incorporación en las partículas de VIH. La interacción entre Gag y ciclofilina A es esencial porque la rotura de esta interacción por la ciclosporina A inhibe la replicación viral.

La región NC de Gag es responsable de reconocer específicamente la así llamada señal de empaquetamiento del VIH. La señal de empaquetamiento consiste en cuatro estructuras en bucle troncales localizadas cerca del extremo 5' del ARN viral y es suficiente para mediar en la incorporación de un ARN heterólogo en viriones del VIH-1. NC se une a la señal de empaquetamiento a través de interacciones mediadas por dos motivos en dedo de cinc. NC también facilita la transcripción reversa.

La región del polipéptido p6 media las interacciones entre Gag p55 y la proteína accesoria Vpr, lo que conduce a la incorporación de Vpr en los viriones en ensamblaje. La región p6 también contiene un así llamado dominio tardío que es necesario para la liberación eficiente de los viriones en gemación de una célula infectada.

El gen pol codifica dos proteínas que contienen las dos actividades necesarias por el virus en la infección temprana, la RT y la proteína integrasa necesaria para la integración del ADN del virus en el ADN de la célula. El producto principal de Pol es escindido por la proteasa del virión para dar el péptido RT amino terminal que contiene actividades necesarias para la síntesis de ADN (ADN polimerasa dirigida por ARN y por ADN, ribonucleasa H) y la proteína integrasa en carboxi terminal.

La RT del VIH es un heterodímero de RT de longitud completa (p66) y un producto de escisión (p51) que carece del dominio integrasa de ARNasa carboxi-terminal. La RT es una de las proteínas más altamente conservadas codificadas por el genoma del retrovirus. Dos actividades principales de la RT son la ADN Pol y la ribonucleasa H. La actividad ADN Pol de la RT usa ARN y ADN como moldes de forma intercambiable y, como todas las ADN polimerasas conocidas no puede iniciar la síntesis de ADN de novo, requiere una molécula preexistente que sirva como cebador (ARN).

La actividad ARNasa H inherente a todas las proteínas RT desempeña el papel esencial temprano en la replicación de eliminar el genoma de ARN a medida que progresa la síntesis de ADN. Degrada selectivamente el ARN de todas las moléculas híbridas de ARN-ADN. Estructuralmente, la polimerasa y la ribo H ocupan dominios separados no solapantes, con el Pol abarcando los dos tercios amino de la Pol.

La subunidad catalítica de p66 se pliega en 5 subdominios distintos. Los 23 amino terminales de éstos tienen la parte de la actividad RT. EL extremo carboxi de éstos es el dominio de ARNasa H. Tras la infección de la célula huésped, el genoma de ARN retroviral se copia en el ADN ds lineal por la transcriptasa inversa que está presente en la partícula infectante. La integrasa (revisada en Skalka AM '99 Adv in Virus Res 52 271-273) reconoce los extremos del ADN viral, los recorta y acompaña al ADN viral a un sitio cromosómico del huésped para catalizar la integración. Muchos Sitios en el ADN huésped pueden ser dianas para la integración. Aunque la integrasa es suficiente para catalizar la integración in vitro, no es la única proteína asociada con el ADN viral in vivo, el complejo grande proteína-ADN viral aislado de las células infectadas se ha denotado complejo de preintegración. Esto facilita la adquisición de los genes de la célula huésped por los genomas virales de la progenie.

La integrasa está formada por 3 dominios distintos, el dominio N terminal, el núcleo catalítico y el dominio C terminal. El dominio central catalítico contiene todos los requisitos para la química de la transferencia de polinucleotidilos.

Se sabe que la proteína Nef produce la eliminación de CD4, el receptor del VIH, de la superficie celular, pero la importancia biológica de esta función es objeto de debate. Adicionalmente, la Nef interacciona con la vía de señalización de las células T e induce un estado activo, que, a su vez, puede estimular una expresión génica más eficiente. Algunos aislados de VIH presentan mutaciones en esta región, que hacen que no codifiquen proteína funcional y que estén gravemente comprometidos en su replicación y patogénesis in vivo.

Las vacunas de ADN usualmente consisten en un vector plasmídico bacteriano en el que se inserta un promotor fuerte, el gen de interés que codifica un péptido antigénico y secuencias de poliadenilación/terminación de la transcripción. El gen de interés puede codificar una proteína completa o, simplemente, una secuencia peptídica antigénica relacionada con el patógeno, tumor u otro agente contra el que se quiera proteger. El plásmido se puede cultivar en bacterias, tales como, por ejemplo, E. coli y después puede aislarse y prepararse en un medio adecuado, dependiendo de la vía de administración... [Seguir leyendo]

1. Una secuencia de nucleótidos ligada en forma operable a un promotor heterólogo, en la que la secuencia de nucleótido codifica para RT optimizada, Nef truncada, p17 Gag optimizada por codón y p24 Gag optimizada por codón, en el orden RT, Nef, p17 Gag, p24 Gag.

2. Una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 en la que la secuencia gag se optimiza por codón para que se parezca al uso de codón en un gen humano altamente expresado y la secuencia de nucleótido tiene un valor de RSCU mayor de 0,5.

3. Una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1 ó 2 en la que el RT se optimiza por codón para que se parezca a un gen de expresión alta.

4. Una secuencia de nucleótidos según cualquier reivindicación precedente en la que el promotor heterólogo es el promotor del gen IE de HCMV.

5. Una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 4 en la que el extremo 5' del promotor comprende el exón 1.

6. Una secuencia de nucleótidos según cualquier reivindicación precedente en la que la RT codifica una mutación para inactivar sustancialmente cualquier actividad de transcriptasa reversa.

7. Una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6 en la que RT se muta sustituyendo el triptófano 229 por Lisina.

8. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un vector según la reivindicación 8 que es un vector viral.

10. Un vector viral según la reivindicación 9 que es un adenovirus defectivo en replicación.

11. Un vector según la reivindicación 9 que es un plásmido de ADN de doble cadena.

12. Una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

13. Una composición farmacéutica que comprende una secuencia de nucleótidos de las reivindicaciones 1 a 7 o un vector de las reivindicaciones 8-11 y un excipiente, diluyente, vehículo o coadyuvante farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición farmacéutica según la reivindicación 13 adaptada para administración intramuscular o intradérmica.

15. Una composición farmacéutica según la reivindicación 13 ó 14, en la que el vehículo es una perla de oro.

16. Un dispositivo de administración intradérmica que comprende una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 13-15.

17. Una secuencia de nucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un vector de las reivindicaciones 8 a 11 o una composición de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, para usar en medicina.

18. Un procedimiento para la producción de un nucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende engarzar de manera operable una secuencia de nucleótidos que codifica RT (optimizada por codón), Nef truncada, p17 Gag (optimizada por codón) y p24 Gag (optimizada por codón) en el orden RT, Nef, p17 Gag, p24 Gag a un promotor heterólogo.