Un polipéptido aislado que consiste en la secuencia enumerada en SEC ID Nº:

16 o una variante de la misma que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en no más del 15 % de los residuos en SEC ID Nº: 16, de forma que el polipéptido potencia la ubicuitinación de IκB fosforilada

Campo técnico

La presente invención se refiere generalmente a composiciones y a procedimientos para modular la activación del factor nuclear κB (NF-κB). La invención se refiere más particularmente a agentes que modulan la ubicuitinación de IκBα y/o IκBβ fosforilados y a procedimientos para tratar enfermedades asociadas a la activación de NF-κB. Los agentes de modulación englobados por la presente invención incluyen ubicuitina-ligasas E3, y porciones y variantes de las mismas.

Antecedentes de la invención

El NF-κB es un factor de transcripción que desempeña una función fundamental en el patrón altamente específico de expresión génica observada para genes de respuesta de fase inmunitaria, inflamatoria y aguda que incluyen interleucina 1, interleucina 8, factor de necrosis tumoral y ciertas moléculas de adhesión a células. Al igual que otros miembros de la familia Rel de activadores de la transcripción, NF-κB es secuestrado en una forma inactiva en el citoplasma de la mayoría de los tipos de células. Una variedad de estímulos extracelulares que incluyen mitógenos, citocinas, antígenos, agentes inductores de estrés, luz UV y proteínas víricas inician una vía de transducción de señales que conduce en última instancia a la liberación y activación de NF-κB.

Importantes moduladores de la activación de NF-κB son las proteínas inhibidoras IκBα yIκBβ (denominadas en este documento IκB) que se asocian a (y así inactivan) NF-κB en el citoplasma de células no estimuladas. La activación y la translocalización nuclear de NF-κB se producen tras la fosforilación inducida por señales de IκB, que conduce a la proteólisis mediante la vía de la ubicuitina. Para IκBα, la fosforilación inducida por estímulos en las serinas 32 y 36 convierte el inhibidor en una diana para la ubicuitinación en las lisinas 21 y 22, produciendo la degradación. Similarmente, la fosforilación de IκBβ en las serinas 19 y 23 convierte el inhibidor en una diana para la ubicuitinación en la lisina 9. Sin embargo, no se ha(n) identificado el (los) componente(s) del sistema de ubicuitina que median en el reconocimiento de IκB.

La degradación de una proteína mediante la vía de la ubicuitina avanza por dos etapas discretas y sucesivas: (a) unión covalente de múltiples moléculas de ubicuitina al sustrato de de proteína, y (b) degradación de la proteína elegida como diana por el complejo del proteasoma 26S. La vía de la ubicuitina consiste en varios componentes que actúan conjuntamente y de una manera jerárquica (para las revisiones véase Ciechanover, Cell 79:13, 1994; Hochstrasser, Curr. Op. Cell. Biol. 7:215, 1995; Jentsch y Schlenker, Cell 82:881, 1995; Deshaies, Trends Cell Biol. 5:428, 1995). Un componente tal, una enzima E1 individual, lleva a cabo la activación de la ubicuitina. Se han caracterizado varias especies principales de enzimas E2 en células de mamífero, plantas y levadura. Las enzimas E2 probablemente se unen a la ligasa E3 (Reiss y Hersko, J. Biol. Chem. 265:3685, 1990; Dohmen y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:7351, 1991) y parece que cada enzima E2 puede actuar con una o más proteínas E3 (Nuber y col., J. Biol. Chem. 271:2795, 1996; Orian y col., J. Biol. Chem. 270:21707, 1995; Stancovski y col., Mol. Cell. Biol. 15:7106, 1995; Gonen y col., J. Biol. Chem. 271:302, 1996).

Sólo se han descrito unas pocas enzimas E3 (ubicuitina-ligasas). E3α (UBR1 en levadura) y E3β de mamífero reconocen sustratos de proteína mediante sus residuos de aminoácidos del extremo N libres (“N-end rule”; Varshavsky, Cell 69:725, 1992; Hershko y Ciechanover, Ann. Rev. Biochem. 61:761, 1992). Cdc53 es probablemente una E3 que participa en la elección como diana de ciclinas G1 fosforiladas (Willems y col., Cell 86:453, 1996). E6-AP participa en el reconocimiento de p53 (Scheffner y col., Cell 75:495, 1993) y se ha identificado una serie de proteínas homólogas a E6-AP únicas (Huibregtse y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:2563, 1995): Nedd4 participa en la degradación del canal de Na+ epitelial (Staub y col., Embo J. 15:2371, 1996) y RSP5 (NIP1) participa en la elección como diana de las permeasas Gap1 y Furl (Hein y col., Mol. Microbiol. 18:77, 1995), mientras que Pub1 elige como diana Cdc25 (Nefsky y Beach, EMBO J. 15:1301, 1996). Varios otras enzimas E3 que se han aislado recientemente parecen estar implicadas en la degradación de c-Fos, un subconjunto de proteínas del músculo, y en el procesamiento de p105, el precursor de NF-κB (Orian y col., J. Biol. Chem. 270:21707, 1995; Stancovski y col., Mol. Cell. Biol. 15:7106, 1995; Gonen y col., J. Biol. Chem. 271:302, 1996). Por tanto, parece que las ligasas representan una gran familia de enzimas la mayoría sin desenmarañar y, excepto por el modo de reconocimiento de las ligasas “de la regla del extremo N” (E3α y E3β), no se han identificado los motivos de reconocimiento de todos los otros sustratos conocidos del sistema de ubicuitina.

Por consiguiente, existe la necesidad en la materia de un entendimiento mejorado de la degradación de IκB mediante la vía de la ubicuitina y de la identificación de moduladores de este procedimiento de degradación para uso en el tratamiento de enfermedades asociadas a la activación de NF-κB. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas.

Resumen de la invención

invención proporciona polipéptidos de ubicuitina-ligasa E3 humana aislada que consisten en la secuencia enumerada en SEC ID Nº: 16 o una variante de la misma que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en no más del 15 % de los residuos de aminoácidos en SEC ID Nº: 16, de forma que el polipéptido potencie la ubicuitinación de IκB fosforilada.

También se proporciona un polipéptido aislado según la reivindicación 2.

La presente invención proporciona además, dentro de otros aspectos, polinucleótidos aislados según las reivindicaciones 3 y 4. Dentro de ciertas realizaciones, tales polinucleótidos pueden codificar una parte de una ubicuitina-ligasa E3 humana, o variante de una parte tal, como se ha descrito anteriormente. También se describen polinucleótidos antisentido que comprenden al menos 10 nucleótidos consecutivos complementarios a tales polinucleótidos. Adicionalmente se proporcionan vectores de expresión que comprenden un polinucleótido tal, y células huésped transformadas o transfectadas con un vector de expresión tal.

Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido o polinucleótido como se ha descrito anteriormente en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable.

Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a una ubicuitina-ligasa E3 humana que tiene una secuencia enumerada en SEC ID Nº:

16. Tales anticuerpos pueden ser monoclonales.

Dentro de otros aspectos se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o fragmento del mismo como se ha descrito anteriormente en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica tal como se ha descrito anteriormente para modular la actividad de NF-κB en un paciente

Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente para tratar un paciente aquejado de un trastorno asociado a activación de NF-κB. Tales trastornos incluyen enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, cáncer e infección vírica.

Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona procedimientos para cribar un agente que modula la actividad de NF-κB que comprende las etapas de: (a) poner en contacto un agente candidato con un polipéptido de ubicuitina-ligasa E3 humana, comprendiendo el polipéptido una secuencia enumerada en SEC ID Nº: 16 o una parte

o variante de la misma que se diferencia en una o más sustituciones, inserciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, de forma que el polipéptido potencia la ubicuitinación de IκB fosforilada, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el polipéptido y el agente candidato; y (b) posteriormente evaluar la capacidad del polipéptido para... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que consiste en la secuencia enumerada en SEC ID Nº: 16 o una variante de la misma que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en no más del 15 % de los residuos en SEC ID Nº: 16, de forma que el polipéptido potencia la ubicuitinación de IκB fosforilada.

2. Un polipéptido aislado que comprende una porción de 200 aminoácidos de una ubicuitina-ligasa E3 humana enumerada en SEC ID Nº: 16 o una variante de la misma que contiene sustituciones de aminoácidos en no más del 15 % de los residuos de dicha porción de SEC ID Nº: 16, en el que la porción o variante de la misma se une a IκB fosforilada e inhibe la ubicuitinación de IκB fosforilada.

3. Un polinucleótido aislado que consiste en la región codificante para un polipéptido según la reivindicación 1.

4. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido según la reivindicación 2.

5. Un vector que comprende un polinucleótido según la reivindicación 3 o la reivindicación 4.

6. Una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión según la reivindicación 5.

7. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) un polipéptido de ubicuitina-ligasa E3 humana, en la que el polipéptido consiste en una secuencia enumerada en SEC ID Nº: 16, o consiste en una porción de 200 aminoácidos de SEC ID Nº: 16, o es una variante de SEC ID Nº: 16 que se diferencia en una o más sustituciones de aminoácidos en no más del 15 % de los residuos en SEC ID Nº: 16, de forma que el polipéptido potencia la ubicuitinación de IκB fosforilada y

(b) un vehículo fisiológicamente aceptable.

8. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) un polipéptido, en la que el polipéptido comprende una porción de 200 aminoácidos de una ubicuitina-ligasa E3 humana enumerada en SEC ID Nº: 16, o comprende una variante de dicha porción que comprende una o más sustituciones de aminoácidos en no más del 15 % de los residuos en SEC ID Nº: 16, en el que la porción o variante de la misma se une a IκB fosforilada e inhibe la ubicuitinación de IκB fosforilada; y

(b) un vehículo fisiológicamente aceptable.

9. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido de ubicuitina-ligasa E3 humana, en la que el polinucleótido consiste en la región codificante para un polipéptido que consiste en una secuencia enumerada en SEC ID Nº: 16, o que consiste en una parte de SEC ID Nº: 16, o que es una variante de SEC ID Nº: 16 que comprende sustituciones en no más del 15 % de los residuos en SEC ID Nº: 16, de forma que el polipéptido potencia la ubicuitinación de IκB fosforilada y

(b) un vehículo fisiológicamente aceptable.

10. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido, en la que el polipéptido comprende una porción de 200 aminoácidos de una ubicuitina-ligasa E3 humana enumerada en SEC ID Nº: 16, o variante de dicha porción que comprende sustituciones en no más del 15 % de los residuos en SEC ID Nº: 16, de forma que el polipéptido se une a IκB fosforilada e inhibe la ubicuitinación de IκB fosforilada; y

(b) un vehículo fisiológicamente aceptable.

11. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) un polinucleótido que consiste en un polinucleótido antisentido del polinucleótido según la reivindicación 4 y que comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos complementarios a un polinucleótido según la reivindicación 4; y

(b) un vehículo fisiológicamente aceptable.

12. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a una secuencia de ubicuitinaligasa E3 humana enumerada en SEC ID Nº: 16.

13. Un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 12, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

14. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 12 en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable.

15. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 14 para uso en la modulación de la actividad de NF-κB en un paciente.

16. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 7-11 ó 14 para uso en el tratamiento de un paciente aquejado de un trastorno asociado a activación de NF-κB.

17. Una composición según la reivindicación 16, en el que el trastorno se selecciona del grupo que consiste en enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, cáncer e infección vírica.

18. Un procedimiento para cribar un agente que modula la actividad de NF-κB que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un agente candidato con un polipéptido aislado de ubicuitina-ligasa E3 humana, en el que el polipéptido comprende una secuencia enumerada en SEC ID Nº: 16, una parte de SEC ID Nº: 16 o variante de SEC ID Nº: 16 que se diferencia en una o más sustituciones, inserciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, de forma que el polipéptido potencia la ubicuitinación de IκB fosforilada, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el polipéptido y el agente candidato; y

(b) posteriormente evaluar la capacidad del polipéptido para potenciar la ubicuitinación de IκB fosforilada, con respecto a una capacidad predeterminada del polipéptido para potenciar la ubicuitinación de IκB fosforilada en ausencia de agente candidato;

e identificar a partir del mismo un agente que modula la actividad de NF-κB.

19. Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que el agente candidato es una molécula pequeña presente dentro de una biblioteca combinatoria.

20. Un polipéptido que comprende una proteína β-TrCP que tiene la secuencia enumerada en SEC ID Nº: 18, o una porción de SEC ID Nº: 18, o variante de SEC ID Nº: 18 que se diferencia en una o más inserciones, deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos en no más del 20 % de los residuos en SEC ID Nº: 18, de forma que el polipéptido potencia la ubicuitinación de IκB fosforilada, para uso en la modulación de la actividad de NF-κB en un paciente.

21. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido que comprende una proteína β-TrCP que tiene la secuencia enumerada en SEC ID Nº: 18, el polipéptido que potencia la ubicuitinación de IκB fosforilada, para uso en el tratamiento de un paciente aquejado de un trastorno asociado a activación de NF-κB.

22. Un polipéptido según la reivindicación 21, en el que el trastorno se selecciona del grupo que consiste en enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, cáncer e infección vírica.

23. Un procedimiento para cribar un agente que modula la actividad de NF-κB que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un agente candidato con un polipéptido aislado que comprende una proteína β-TrCP que tiene la secuencia enumerada en SEC ID Nº: 18, de forma que el polipéptido potencia la ubicuitinación de IκB fosforilada, en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la interacción entre el polipéptido y el agente candidato; y

(b) posteriormente evaluar la capacidad del polipéptido para potenciar la ubicuitinación de IκB fosforilada, con respecto a una capacidad predeterminada del polipéptido para potenciar la ubicuitinación de IκB fosforilada en ausencia de agente candidato;

e identificar a partir del mismo un agente que modula la actividad de NF-κB.

24. Un procedimiento según la reivindicación 23, en el que el agente candidato es una molécula pequeña presente dentro de una biblioteca combinatoria.

25. Un polipéptido aislado que consiste en una porción de una ubicuitina-ligasa E3 humana enumerada en SEC ID Nº: 16, o variante de la misma que contiene sustituciones de aminoácidos en no más del 15 % de los residuos de dicha porción de SEC ID Nº: 16, en el que la porción o variante de la misma se une a IκB fosforilada e inhibe la ubicuitinación de IκB fosforilada.

26. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido en la que el polipéptido consiste en una porción de una ubicuitina-ligasa E3 humana enumerada en SEC ID Nº: 16 de forma que el polipéptido se une a IκB fosforilada e inhibe la ubicuitinación de IκB fosforilada; y

(b) un vehículo fisiológicamente aceptable.

27. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) un polinucleótido antisentido que consiste en 10 nucleótidos consecutivos complementarios a un polinucleótido según la reivindicación 3 o la reivindicación 4; y

b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

28. Una porción de un polinucleótido complementario a un polinucleótido según la reivindicación 4 para uso como una sonda, en la que la porción tiene una longitud de al menos 10 nucleótidos.

29. Una porción de un polinucleótido complementario a un polinucleótido según la reivindicación 4 para uso en la modulación de la expresión génica, en la que la porción tiene una longitud de al menos 10 nucleótidos.