Un método de sintetizar ácido shikímico de una fuente de carbono comprendiendo convertir la fuente de carbono en ácido shikímico con un E.

coli recombinante que comprende el gen aroF FBR codificando un isoenzima de 3desoxi-D-arabino-heptulosonato-7 fosfato sintasa insensible a la inhibición por retroalimentación por amino ácidos aromáticos u otras moléculas aromáticas, el gen codificando 3-deshidroquinata sintasa, el gen codificando 3deshidroquinata deshidratasa, y el gen codificando shikimato deshidrogenasa, en un medio de fermentación y controlando la proporción molar de ácido shikímico a ácido quínico reduciendo o eliminando el equilibrio de ácido shikímico a ácido quínico añadiendo de un análogo de glucosa no hidrolizable que es metil glucopiranosida al medio de fermentación, en donde el gen codificando la kinasa de shikimato en el E. coli recombinante es eliminado totalmente o en parte, o es mutado, por lo tanto, eliminando, inhibiendo o reduciendo la actividad de la quinasa de shikimato

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a la producción de ácido shikímico y más específicamente, a métodos de producir ácido shikímico de la bioconversión de una fuente de carbono.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El ácido shikímico es un sintón quiral atractivo con su altamente funcionalizado anillo carbocíclico de seis eslabones y múltiples centros asimétricos. Un intermediario metabólico de biosíntesis de amino ácido aromático, el ácido shikímico se ha convertido en un material de partida quiral esencial en la síntesis de los inhibidores de la neuraminidasa efectivo en el tratamiento de la gripe. Kim. C.U. y otros, J. Am. Chem. Soc. 119:681 (1997); Rohloff,

J.C. y otros, J. Org. Chem 63;4545 (1998). El quiral, así como los químicos aromáticos, pueden también ser sintetizados del ácido shikímico. Por ejemplo, el ácido catalizado de la deshidratación del ácido shikímico proporciona ácido p-hidroxibenzoico (Ekymann, J.F., Ver. Dtch. Chem. Ges. 24:1278 (1891)). El ácido phidroxibenzoico, que tiene una producción anual de 7 x 106 kg, es el precursor clave de los parabenos y un monómero utilizado en la síntesis de polímeros de cristal liquido. El ácido shikímico también ha sido utilizado recientemente como el punto de partida para la síntesis de un gran catálogo combinacional de moléculas. Tan, D.S. y otros, J. Am. Chem. Soc. 120:8565 (1998).

El ácido shikímico es obtenido por procesos de aislamiento multi-paso tediosos de plantas. Desafortunadamente, el aislamiento actual del ácido shikímico de la fruta de las plantas Illicium (Haslem, E., Shikimic Acid: Metabolism and Metabolites, Wiley & Sons, New York, pp. 40-42 (1993)) imposibilita su uso en síntesis a nivel de kilogramo.

Por lo tanto, sería deseable proporcionar un método para producir grandes cantidades de ácido shikímico. También sería deseable si tal método fuese rentable, utilizando materiales de partida baratos. Sería además deseable que el método emplease compuestos no tóxicos y que fuese medioambientalmente benigno.

La WO 96/34961 describe métodos para mejorar el flujo de carbono en un sistema de una célula huésped para mejorar la producción biosintética de compuestos de la misma, siendo las células huésped seleccionadas en base a ser fenotípicamente Pts-/glucosa+. Tales células huésped son capaces de transportar glucosa sin consumir fosfoenolpiruvato, resultando en la conservación del fosfoenolpiruvato que puede ser redirigido al sistema para mejorar la producción de los compuestos deseados a lo largo del sistema. Se ha demostrado que los mutantes Pts/glucosa+ son ventajosos para la producción mejorada de amino ácidos aromáticos.

La WO 94/14955 revela una eficiencia de producción mejorada de compuestos aromáticos por el sistema común de una célula huésped. Es realizada aumentando la expresión de las especies de enzimas que actúan en intermediarios de sustrato en pasos de reacción limitadores de la velocidad identificados en el sistema. Los transformantes de células procariotas son descritos comprendiendo secuencias de ADN exógeno codificando las especies de enzimas, 3-deshidroquinata sintasa, shikimato kinasa, 5-enolpiruvato-shikimato-3-fosfato sintasa y corismato sintasa. Estos transformantes pueden ser además transformados con secuencias de ADN exógeno codificando las especies de enzimas transcetolasa y DAHP sintasa. En una realización, una o más de las secuencias de ADN que codifican las especies de enzimas son incorporadas en el genoma del transformante.

La US-A-5798236 revela métodos para la síntesis de compuestos orgánicos quinoides de una fuente de energía renovable, como la glucosa. El método comprende mejorar la cantidad de equivalentes de glucosa introducidos en el sistema, bloqueando el sistema común para acumular deshidroquinata y convirtiendo la deshidroquinata en ácido quínico.

La publicación de Kikuchi y otros.: Mutational analysis of the feedback sites of phenylalanine-sensitive 3deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase of Escherichia coli.” Appl. Environ. Microbiol. Vol. 63, nº 2, Febrero 1997, páginas 791-762, XP002927102 revela que en la Escherichia coli, el aroF, aroG, y aroH codifican isoenzimas 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato sintasa que son inhibidos por retroalimentación por la tirosina, fenilalanina, y triptófano, respectivamente. La mutagénesis química in vitro de los genes aroG clonados es usada para identificar residuos y regiones de polipéptidos esenciales para la inhibición por retroalimentación de la fenilalanina.

La publicación de Whipp et al.: “A reassessment of the relations between aroK- and aroL-encoded shikimate kinase enzymes of Escherichia coli”, Journal of Bacteriology, vol. 177, nº 6, Marzo 1995, páginas 1627-1629, XP002927103 revela que en el transcurso de la secuenciación de los genes aroK, se encontraron un número de errores en la secuencia publicada. LA secuencia corregida altera la longitud de la región codificante del aroK de tal forma que las proteínas aroK y aroL son ahora de una longitud comparable y la homología entre ellas aumenta la longitud total de los dos enzimas.

RESUMEN DE LA INVENCION

Se proporciona un esquema de síntesis de bioingeniería para la producción de ácido shikímico de una fuente de carbono. Los métodos de bioconversión de la presente invención comprenden la conversión por catalizado de microbios de una fuente de carbono a ácido shikímico. Como se muestra en el esquema de síntesis de la Figura 1, el paso de conversión por catalizado de microbios de la presente invención requiere cuatro enzimas que pueden ser proporcionados por un microbio recombinante. El microbio recombínate es la Escherichia coli diseñada para causar la reducción de la 3-deshidroshikimato a ácido shikímico y para inhibir cualquier conversión adicional de ácido shikímico a lo largo del sistema biosintético de amino ácido aromático.

El método de síntesis biocatalítica para el ácido shikímico proporcionado en la presente, se cree que es medioambientalmente benigno, económicamente atractivo, y utiliza abundantes fuentes renovables como material de partida.

Se harán evidentes objetos, ventajas, y características adicionales de la presente invención de la siguiente descripción y las reivindicaciones añadidas, tomadas en conjunción con los dibujos acompañantes.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Las ventajas varias de la presente invención se harán evidentes para alguien experto en la materia leyendo la especificación siguiente y las reivindicaciones adjuntas haciendo referencia a los siguientes dibujos en los que:

La Figura 1 es una ilustración esquemática del esquema de síntesis de bioingeniería de la presente invención para producir ácido shikímico; y

La Figura 2 es un gráfico que muestra el equilibrio de los ácidos shikímico y quínico catalizado por SP1.1/pKD12.112.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

Se proporciona en la presente un esquema de síntesis de bioingeniería para la producción de ácido shikímico de una fuente de carbono. También se proporcionan los métodos para producir ácido shikímico de una fuente de carbono en base al esquema de síntesis.

Se proporciona un método en donde la fuente de carbono es convertida en ácido shikímico por un microbio recombinante. La manipulación del sistema biosintético del amino ácido aromático común del microbio resulta en una producción significativa de ácido shikímico cuando el microbio recombinante es cultivado en presencia de una fuente de carbono. La fuente de carbono es convertida en 3-desoxi-D-arabino-heptulosanato-7-fosfato (DAHP) que es posteriormente convertido por 3-deshidroquinata sintasa en 3-deshidroquinata (DHQ) que es después deshidratada en 3-deshidroshikimato (DHS) por 3-deshidroquinata deshidratasa (c, Figura 1). El 3-deshidroshikimato es convertido en ácido shikímico por deshidrogenasa de shikimato (d, Figura 1). El metabolismo del ácido shikímico puede ser impedido bloqueando o impidiendo la actividad quinasa del shikimato (e, f, Figura 1), permitiendo por tanto la acumulación de cantidades significativas de ácido shikímico. En una realización preferida, el microbio será incapaz de reabsorber el ácido shikímico del medio debido a una mutación en la captación de shikimato (shiA). Por lo tanto, una vez formado, el ácido shikímico no puede ser convertido en ácido quínico o cualquier otra molécula... [Seguir leyendo]

1. Un método de sintetizar ácido shikímico de una fuente de carbono comprendiendo convertir la fuente de carbono en ácido shikímico con un E. coli recombinante que comprende el gen aroFFBR codificando un isoenzima de 3desoxi-D-arabino-heptulosonato-7 fosfato sintasa insensible a la inhibición por retroalimentación por amino ácidos aromáticos u otras moléculas aromáticas, el gen codificando 3-deshidroquinata sintasa, el gen codificando 3deshidroquinata deshidratasa, y el gen codificando shikimato deshidrogenasa, en un medio de fermentación y controlando la proporción molar de ácido shikímico a ácido quínico reduciendo o eliminando el equilibrio de ácido shikímico a ácido quínico añadiendo de un análogo de glucosa no hidrolizable que es metil glucopiranosida al medio de fermentación, en donde el gen codificando la kinasa de shikimato en el E. coli recombinante es eliminado totalmente o en parte, o es mutado, por lo tanto, eliminando, inhibiendo o reduciendo la actividad de la quinasa de shikimato.

2. El método de la Reivindicación 1, en donde el gen codificando la deshidogenasa de shikimato es el gen aroE.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el gen aroE es introducido en el E. coli en un plásmido.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el plásmido es pKD12.112, obtenible del E. coli SP1/pKD12.112 identificado por el número de designación de la ATCC 98905.

5. El método de la Reivindicación 3, en donde el plásmido es pKD12.138, obtenible del E. coli Sp1.1/pKD12.138 identificado por el número de designación de la ATCC 207055.

6. El método de la Reivindicación 1, en donde el gen codificando la sintasa de 3-deshidroquinata es el gen aroB.

7. El método de la Reivindicación 6, en donde el gen aroB es introducido en el E. coli por inserción en el locus serA del E. coli.

8. El método de la Reivindicación 1, en donde el gen aroFFBR es introducido en el E. coli en un plásmido.

9. El método de la Reivindicación 8, en donde el plásmido es pKD12.112, obtenible del E. coli SP1.1/pKD12.112 identificado por el número de designación de la ATCC 98905.

10. El método de la Reivindicación 8, en donde el plásmido es pKD12.138, obtenible del E. coli Sp1.1/pKD12.138 identificado por el número de designación de la ATCC 207055.

11. El método de la Reivindicación 1, en donde la proporción molar de ácido shikímico a ácido quínico es mayor que

9.

12. El método de la Reivindicación 1, en donde la metil glucopiranosida es metil-α-glucopiranosida, metil-βglucopiranosida o una mezcla de las mismas.

13. El método de la Reivindicación 1, comprendiendo además eliminar, mutar o disminuir los niveles de expresión de los genes aroL y aroK.

14. El método de la Reivindicación 1, en donde el E. coli recombinante comprende: a) un casete aroB insertado en el locus serA; b) locus aroL y aroK mutados; y c) un plásmido comprendiendo insertos de genes aroE, aroFFBR y serA.

15. El método de la Reivindicación 14, en donde el plásmido es pKD12.112, obtenible del E. coli SP1.1/pKD12.112 identificado por el número de designación de la ATCC 98905.

16. El método de la Reivindicación 1, en donde el E. coli recombinante es E. coli Sp1.1/pKD12.112 identificado por el número de designación de la ATCC 98905.

17. El método de la Reivindicación 1, en donde la concentración de metil glucopiranosida en el medio de fermentación es de 0,5 mM a 1,0 mM.